细胞生物学学习笔记 2 | 细胞生物学研究方法：从显微成像到基因编辑
对应课件： Lecture 2 - Methods 2026
本章核心内容： 荧光显微与电子显微技术、荧光探针与流式细胞术、同位素示踪、细胞组分分离、蛋白质纯化与检测、蛋白质互作研究方法、分子生物学与遗传学方法、模式生物
复习目标： 掌握各类显微技术的原理与适用场景；理解细胞组分分离与蛋白质纯化的基本策略；能区分检测蛋白质互作的不同方法；熟悉基因功能研究的常用手段（敲除、敲低、敲入、CRISPR）。
一、本章总览：研究细胞的方法体系
主线：
| 研究目的 | 主要方法 |
|---|---|
| 观察细胞 | 光学显微镜（明场、相差、DIC、暗场、荧光、共聚焦）、电子显微镜（TEM、SEM、冷冻蚀刻、cryo-EM） |
| 标记与追踪 | 荧光探针（GFP、fura-2、DAPI）、同位素（\(^{32}\text{P}\)、\(^{35}\text{S}\)、\(^{3}\text{H}\)）、脉冲-追踪（pulse-chase） |
| 分离细胞器 | 细胞组分分离（差速离心、密度梯度离心） |
| 纯化与检测蛋白质 | 柱层析、SDS-PAGE、等电聚焦、2D 电泳、免疫印迹、质谱 |
| 研究蛋白质互作 | GST pull-down、FRET、酵母双杂交、噬菌体展示、SPR（Biacore） |
| 研究基因功能 | 定点突变、RNAi、基因敲除/敲入、LoxP-Cre、CRISPR/Cas9、RNA-seq |
考试提示： 每种方法的原理和主要应用是重点，而不是具体操作细节。
二、光学显微镜（Light Microscopy）
1. 分辨率基础
光学显微镜的最大分辨率约为 0.2 μm（200 nm），受可见光波长限制。这决定了它能看到细胞整体、细胞核、染色体等较大结构，但看不到核糖体、膜结构细节。
2. 四种观察活细胞的光学显微技术
| 技术 | 原理 | 特点与适用场景 |
|---|---|---|
| 明场（bright-field） | 光直接透射过样品 | 最简单，对比度低，适合染色后的固定样品 |
| 相差（phase-contrast） | 将光通过透明样品产生的相位差转换为亮度差 | 可观察未染色活细胞，能看清细胞内部结构 |
| 微分干涉（DIC / Nomarski） | 偏振光分成两束相干光，经样品后重新组合产生干涉 | 细胞有浮雕感，适合观察活细胞动态 |
| 暗场（dark-field） | 只检测样品侧面散射的光 | 背景暗、样品亮，适合观察未染色透明样品 |
记忆点： 相差看“密度差”，DIC 看“厚度差”（浮雕感），暗场看“散射光”。
3. 荧光显微镜（Fluorescence Microscopy）
基本原理
荧光分子吸收特定波长（激发光，excitation）后，发射更长波长（发射光，emission）的光。荧光显微镜通过滤光片系统分离激发光和发射光。
光路关键部件
| 部件 | 功能 |
|---|---|
| 第一滤光片（excitation filter） | 只让特定波长的激发光通过（如 450–490 nm 蓝光） |
| 二向色镜（beam-splitting mirror / dichroic mirror） | 反射短波长激发光到样品，透射长波长发射光 |
| 第二滤光片（emission filter / barrier filter） | 只让特定发射光通过，阻挡残余激发光 |
常用荧光染料与蛋白
| 荧光基团 | 激发/发射（约） | 用途 |
|---|---|---|
| DAPI | 358 / 461 nm | 染 DNA（细胞核） |
| GFP | 488 / 507 nm | 蛋白定位（基因融合标签） |
| FITC | 495 / 519 nm | 抗体标记 |
| Cy3 | 550 / 570 nm | 抗体标记 |
| Cy5 | 650 / 670 nm | 抗体标记 |
| Alexa 568 | 578 / 603 nm | 抗体标记 |
4. 共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）
与常规荧光显微镜的关键区别
普通荧光显微镜会收集来自焦平面以外（上下层）的荧光，导致图像模糊。共聚焦显微镜通过**针孔（pinhole）**只收集焦平面上的光，从而排除焦外光，获得清晰的光学切片（optical section）。
主要应用
- Z 轴序列扫描（Z-stack）：逐层扫描，重建细胞或组织的三维结构；
- 最大强度投影（Maximum Intensity Projection, MIP）：将 Z-stack 中各层最亮点投影到一张图上；
- 多色成像：同时观察多种蛋白定位；
- 活细胞成像：观察动态过程。
课件中的例子： 海胆受精卵有丝分裂纺锤体（anti-tubulin 抗体染色），普通荧光下模糊，共聚焦下可清晰看到纺锤体微管纤维。
5. 超分辨率成像技术
| 技术 | 原理简述 |
|---|---|
| SIM（structured illumination microscopy） | 用结构化照明图案提高分辨率 |
| STORM（stochastic optical reconstruction microscopy） | 单分子定位，逐点重建 |
| Deconvolution（去卷积） | 通过算法去除光学系统的模糊效应 |
课件中展示了 ERGIC 与 COPII、LC3 与 IL1B 等蛋白的超分辨率共定位图像，以及中国科学家李栋发展的 GI-SIM（grazing-incidence SIM）用于活细胞中溶酶体、ER、微管的动态成像。
6. 无标记三维光学衍射断层扫描（ODT）
课件中提到陈良怡教授发展的 label-free 3D optical diffraction tomography (ODT)，无需荧光标记即可获得细胞的三维折射率分布图像。
7. 间接免疫细胞化学（Indirect Immunocytochemistry）
原理
- 一抗（primary antibody）：识别目标抗原（antigen A）；
- 二抗（secondary antibody）：带有荧光染料、辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）或胶体金等标记，识别一抗。
优点
- 信号放大：多个二抗可结合一个一抗；
- 通用性：同一二抗可用于多种一抗；
- 标记灵活：可换不同标记的二抗实现不同检测目的。
8. 时间延迟显微技术（Time-lapse Microscopy）
在活细胞培养条件下，按固定时间间隔连续拍照，观察细胞运动、分裂、囊泡运输等动态过程。课件中展示了培养成纤维细胞在 0–34 min 内的运动过程。
三、电子显微镜（Electron Microscopy, EM）
1. 为什么需要电子显微镜？
电子束的波长远小于可见光（约 0.004 nm），因此电子显微镜的分辨率远高于光学显微镜，可达 0.1–0.2 nm（原子级）。但电子束在空气中会被散射，因此电镜需要高真空，样品必须固定、脱水、包埋，不能观察活细胞。
2. 透射电镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）
原理
电子束穿过超薄切片（通常 50–100 nm），经电磁透镜聚焦成像。样品中电子密度高的区域（如被锇酸染色的膜）散射电子，在图像上显示为暗区。
样品制备流程
- 固定（fixation）：常用戊二醛（glutaraldehyde）和四氧化锇（OsO₄）；
- 脱水：乙醇或丙酮梯度脱水；
- 包埋（embedding）：环氧树脂（如 Epon、Araldite）；
- 超薄切片（ultrathin sectioning）：用超薄切片机切 50–100 nm 薄片；
- 染色：醋酸铀、柠檬酸铅等重金属染色。
应用
- 观察细胞内部超微结构（细胞器、膜、核糖体、细胞骨架）；
- 免疫电镜（immuno-EM）：用胶体金标记抗体，定位特定蛋白。
3. 扫描电镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）
原理
电子束扫描样品表面，收集二次电子（secondary electrons）或背散射电子成像。样品表面需喷镀金属（如金、铂）以增加导电性并防止电子积累。
应用
- 观察细胞表面形貌（微绒毛、纤毛、伪足、细胞间连接）；
- 立体感强，适合表面结构研究。
4. 冷冻蚀刻（Freeze-Etching / Freeze-Fracture）
原理
- 样品快速冷冻；
- 用刀片断裂，断裂面常沿脂双层中间走；
- 升华表面冰（etching）暴露更多结构；
- 喷镀铂-碳形成 replica（复型）；
- 用 TEM 观察复型。
应用
- 观察膜内蛋白颗粒分布（如质膜 P 面与 E 面）；
- 观察核孔、紧密连接、间隙连接等膜结构。
5. 冷冻电镜（Cryo-Electron Microscopy, Cryo-EM）
原理
样品在玻璃态冰（vitreous ice）中快速冷冻，不经过固定和染色，保持近生理状态。通过单颗粒重建（single-particle reconstruction）或电子断层扫描（electron tomography）解析结构。
应用
- 解析蛋白质、病毒、核糖体等大分子复合物的高分辨率结构；
- 2017 年诺贝尔化学奖授予 Jacques Dubochet、Joachim Frank、Richard Henderson。
6. 其他电子显微技术
| 技术 | 原理与应用 |
|---|---|
| 负染（negative staining） | 用重金属盐（如磷钨酸）包裹样品，样品呈亮区，适合观察病毒、蛋白纤维、微丝 |
| 免疫胶体金（immunogold） | 金颗粒标记抗体，用于定位特定蛋白（如过氧化物酶体中的过氧化氢酶） |
| 原子力显微镜（AFM） | 通过探针与样品表面原子间作用力成像，可获得纳米级表面形貌 |
| 扫描隧道显微镜（STM） | 利用隧道电流，可达单原子分辨率，可在低温下操纵原子 |
四、荧光探针与流式细胞术
1. 检测细胞内 Ca²⁺
| 探针 | 原理 |
|---|---|
| 水母素（aequorin） | 来自水母的发光蛋白，与 Ca²⁺ 结合后发光，可检测细胞内 Ca²⁺ 变化 |
| Fura-2 | 荧光染料，与 Ca²⁺ 结合后激发光谱发生偏移，可定量细胞内 Ca²⁺ 浓度 |
课件中展示了 Fura-2 在小脑浦肯野细胞（Purkinje cell）中显示 Ca²⁺ 浓度梯度的图像，颜色从蓝到红表示 Ca²⁺ 浓度由低到高。
2. GFP：活细胞蛋白定位的利器
- 来自水母（jellyfish）的绿色荧光蛋白；
- 发色团（chromophore）由三个氨基酸残基翻译后形成；
- 通过基因融合（GFP tag）可追踪目标蛋白的定位和动态；
- 变体：CFP（青色）、YFP（黄色）、RFP（红色）等，用于多色成像和 FRET。
3. 荧光激活细胞分选（Fluorescence-Activated Cell Sorter, FACS）
原理
- 细胞悬液经喷嘴形成液滴；
- 激光照射液滴中的细胞，检测荧光信号和散射光；
- 带电荷的液滴在电场中偏转，分选到不同收集管中。
应用
- 根据表面标志物分选特定细胞类型；
- 定量检测细胞内蛋白质和核酸含量；
- 单细胞分选用于单细胞测序。
五、同位素示踪（Isotope Probes）
1. 常用放射性同位素
| 同位素 | 半衰期 | 用途 |
|---|---|---|
| \(^{32}\text{P}\) | 14 天 | 标记 ATP、核酸 |
| \(^{131}\text{I}\) | 8.1 天 | 标记蛋白质（也发 γ 射线） |
| \(^{35}\text{S}\) | 87 天 | 标记蛋白质（甲硫氨酸/半胱氨酸） |
| \(^{14}\text{C}\) | 5570 年 | 标记有机物 |
| \(^{45}\text{Ca}\) | 164 天 | 标记钙 |
| \(^{3}\text{H}\) | 12.3 年 | 标记小分子、核苷酸 |
2. 脉冲-追踪实验（Pulse-Chase）
原理
- 脉冲（pulse）：短时间内加入放射性标记物（如 \(^{35}\text{S}\)-Met），新合成的蛋白质被标记；
- 追踪（chase）：洗去放射性标记，换成非放射性培养基，随时间取样；
- 观察放射性在不同细胞组分或不同蛋白形式中的分布变化。
经典应用
- 胰岛素生物合成追踪：Palade 等用脉冲-追踪结合 EM 放射自显影，证明分泌蛋白从 ER → Golgi → 分泌颗粒的运输路径；
- 激素分泌与受体周转：如 SRIF 分泌、TGF-β 受体（TβRII）成熟与降解。
六、细胞组分分离（Cell Fractionation）
1. 基本原理
细胞匀浆（homogenate）后，不同细胞器因大小、形状、密度不同，在离心力场中沉降速度不同，从而被分离。
2. 差速离心（Differential Centrifugation）
按离心力从小到大逐级离心，依次沉淀不同组分：
| 离心条件（示例） | 沉淀组分 |
|---|---|
| 600 × g，10 min | 细胞核（nuclei） |
| 15,000 × g，5 min | 线粒体、叶绿体、溶酶体、过氧化物酶体 |
| 100,000 × g，60 min | 质膜、微粒体（ER 碎片）、大得多核糖体 |
| 300,000 × g，2 h | 核糖体亚基、小多核糖体 |
| 上清 | 细胞质基质（cytosol） |
3. 速度沉降 vs 平衡沉降
| 类型 | 原理 | 应用 |
|---|---|---|
| 速度沉降（velocity sedimentation） | 在蔗糖梯度（5–20%）中按大小和形状不同沉降速度分离 | 分离不同大小的细胞器或复合物 |
| 平衡沉降（equilibrium sedimentation） | 在陡蔗糖梯度（如 20–70%）或 CsCl 梯度中，颗粒移动到密度相等的位置 | 分离不同密度的细胞器（如溶酶体 1.12、线粒体 1.18、过氧化物酶体 1.23 g/cm³） |
4. 免疫纯化（Immuno-purification）
用针对特定蛋白的抗体（如 anti-clathrin）结合到固相支持物上，从细胞匀浆中特异性捕获带该蛋白的囊泡或复合物（如网格蛋白包被囊泡）。
5. 无细胞体系（Cell-Free Systems）
在体外用分离的组分重建细胞过程，是研究机制的重要手段。
经典例子
- Golgi 囊泡运输：Rothman 等将来自突变细胞（缺乏 GlcNAc 转移酶 I）的“供体”Golgi 与野生型“受体”Golgi 混合，加入 ATP 和细胞质，检测病毒糖蛋白是否被 \(^{3}\text{H}\)-GlcNAc 修饰，证明囊泡在 Golgi 堆叠间运输。
- LC3 脂化实验：用 Atg5 敲除细胞的膜与野生型细胞质混合，加入 GTP 和 ATP，检测 LC3-I 向 LC3-II 的转化（自噬体形成的关键步骤）。
意义： 无细胞体系使复杂的细胞过程可以在受控条件下拆解分析，是细胞生物学研究的核心策略之一。
七、蛋白质纯化与检测
1. 柱层析（Column Chromatography）
| 类型 | 原理 | 特点 |
|---|---|---|
| 凝胶过滤（gel-filtration / size-exclusion） | 多孔珠，小分子进入孔内被滞留，大分子先流出 | 按大小分离，大分子先出 |
| 离子交换（ion-exchange） | 带电荷的珠与带相反电荷的蛋白结合，用盐梯度洗脱 | 按电荷分离 |
| 亲和层析（affinity） | 固相上偶联特定配体（如抗体、底物、谷胱甘肽），特异结合目标蛋白 | 纯度最高，常作为最后一步 |
2. SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）
原理
- SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质变性并带上均匀负电荷；
- 巯基乙醇（mercaptoethanol）还原二硫键；
- 蛋白质在电场中按分子量分离，小分子跑得快。
应用
- 检测蛋白质纯度；
- 估计分子量；
- 配合免疫印迹（Western blot）检测特定蛋白。
3. 等电聚焦（Isoelectric Focusing, IEF）
原理
在 pH 梯度中，蛋白质移动到其**等电点（pI）**位置时净电荷为零，不再迁移。
4. 双向凝胶电泳（2D Gel）
原理
- 第一维：IEF，按 pI 分离；
- 第二维：SDS-PAGE，按分子量分离。
应用
- 分离复杂蛋白质混合物（如全细胞裂解液）；
- 比较不同处理条件下蛋白质表达差异；
- 配合质谱鉴定蛋白质。
5. 免疫印迹（Immunoblotting / Western Blot）
流程
- SDS-PAGE 分离蛋白质；
- 电转移（electrotransfer）到膜上（如硝酸纤维素膜、PVDF 膜）；
- 一抗孵育，识别目标蛋白；
- 酶标二抗孵育；
- 加底物显色或化学发光检测。
应用
- 检测特定蛋白的表达与分子量；
- 半定量比较不同样品中蛋白表达水平。
6. 质谱（Mass Spectrometry, MS）
原理
- 蛋白质酶切（如胰蛋白酶）成肽段；
- 肽段电离（如 MALDI 或 ESI）；
- 测量肽段的质荷比（m/z）；
- 与数据库比对，鉴定蛋白质。
应用
- 从 2D 胶中切取单个蛋白点进行鉴定；
- 大规模蛋白质组学分析；
- 串联质谱（MS/MS）可推断部分氨基酸序列。
八、蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interactions, PPI）
1. GST Pull-Down
原理
- 将目标蛋白 X 与 GST（谷胱甘肽 S-转移酶）融合表达；
- 融合蛋白结合到谷胱甘肽包被的珠上；
- 加入细胞裂解液，与 X 互作的蛋白被捕获；
- 用谷胱甘肽洗脱，SDS-PAGE 检测。
应用
- 体外验证已知或推测的蛋白互作；
- 筛选互作蛋白。
2. FRET（荧光共振能量转移）
原理
- 两个荧光蛋白（如 CFP 和 YFP）分别融合到蛋白 X 和 Y；
- 当 X 和 Y 距离足够近（<10 nm）时，激发 CFP 可导致 YFP 发射荧光（能量转移）；
- 检测 YFP 荧光即可判断互作。
应用
- 活细胞中实时监测蛋白互作；
- 检测构象变化。
3. 酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid）
原理
- 将诱饵蛋白（bait）与 DNA 结合域（BD）融合；
- 将猎物蛋白（prey）与转录激活域（AD）融合；
- 若 bait 与 prey 互作，BD 与 AD 靠近，激活报告基因表达。
应用
- 筛选 cDNA 文库中的互作蛋白；
- 验证已知互作。
4. 噬菌体展示（Phage Display）
原理
- 将外源肽段或蛋白与噬菌体外壳蛋白融合，展示在噬菌体表面；
- 用靶分子（如抗体、受体）筛选结合的噬菌体；
- 回收并测序，获得编码序列。
应用
- 筛选特异性结合肽或抗体；
- 课件例子：将噬菌体文库注射到脑肿瘤小鼠体内，筛选能特异性结合肿瘤血管的肽段。
5. 表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR / Biacore）
原理
- 将诱饵分子固定在金膜表面；
- 流入猎物分子溶液；
- 分子结合改变金膜表面折射率，导致共振角变化；
- 实时监测结合（association）和解离（dissociation）曲线，计算 \(K_d\)。
应用
- 定量测定蛋白-蛋白、蛋白-小分子、抗原-抗体的结合亲和力；
- 无需标记，实时检测。
九、分子生物学与遗传学方法
1. 定点突变（Site-Directed Mutagenesis）
原理
- 设计含突变碱基的寡核苷酸引物；
- 以质粒模板进行 PCR 扩增；
- DNA 聚合酶延伸、连接酶封闭；
- 转化细胞，筛选含突变基因的克隆。
应用
- 研究特定氨基酸对蛋白功能的影响；
- 构建点突变疾病模型。
2. 将物质导入细胞
| 方法 | 原理 |
|---|---|
| 显微注射（microinjection） | 玻璃微针直接注射到细胞质或细胞核 |
| 电穿孔（electroporation） | 短暂电脉冲在膜上形成瞬时可逆孔道 |
| 脂质体介导（lipid-mediated） | 脂质体与质膜融合，将内容物释放到细胞质 |
| 金颗粒介导（gold particle-mediated / gene gun） | DNA 包被金颗粒，高压射入细胞 |
3. 异位过表达（Ectopic Misexpression）
在非正常位置或时间表达某基因，观察表型变化。
课件例子
- Wnt 异位表达：在胚胎中异位表达 Wnt，导致形成第二体轴；
- Dapper2 过表达：在斑马鱼中过表达 Dapper2，导致眼睛融合（eye fusion），证明其在发育中的作用（Zhang et al., 2004, Science）。
4. RNA 干扰（RNA Interference, RNAi）
原理
- 双链 RNA（dsRNA）被 Dicer 切割成小干扰 RNA（siRNA）；
- siRNA 与 RISC 复合物结合，降解同源 mRNA；
- 导致基因表达敲低（knockdown），而非完全敲除。
形式
- siRNA：体外合成，直接导入细胞，瞬时敲低；
- shRNA：通过载体在细胞内表达短发夹 RNA，可稳定敲低。
应用
- 研究基因功能；
- 课件例子：线虫（C. elegans）中通过喂食表达 dsRNA 的 E. coli 实现基因敲低。
5. 基因敲除、敲入与替换
| 类型 | 结果 |
|---|---|
| 基因替换（gene replacement） | 用突变基因替换正常基因，只有突变基因有活性 |
| 基因敲除（gene knockout） | 破坏目标基因，使其无活性 |
| 基因添加（gene addition） | 在基因组中额外插入一个基因，正常基因和额外基因都有活性 |
6. 基因敲除小鼠的制备
流程
- 构建含同源臂的替换载体（含 neo\(^r\) 正筛选标记和 tk\(^{HSV}\) 负筛选标记）；
- 电穿孔导入 ES 细胞；
- 同源重组（homologous recombination）：目标基因被破坏；
- 随机插入（nonhomologous recombination）：tk 基因插入，细胞对 ganciclovir 敏感；
- 用 neomycin（正筛选）和 ganciclovir（负筛选）筛选；
- 将正确重组的 ES 细胞注射到囊胚腔；
- 产生嵌合体小鼠（chimeric mice）；
- 与野生型小鼠交配，获得杂合子；
- 杂合子互交，获得纯合敲除小鼠。
7. 条件性敲除：LoxP-Cre 系统
原理
- LoxP：34 bp 的 DNA 识别位点；
- Cre 重组酶：来自 P1 噬菌体，识别 LoxP 位点并介导重组；
- 将 LoxP 位点置于目标基因两侧（floxed 基因）；
- 在表达 Cre 的细胞中，LoxP 位点间的序列被切除，实现组织特异性或时间特异性敲除。
应用
- 研究特定组织或发育阶段中基因的功能；
- 避免全身敲除导致的胚胎致死。
8. CRISPR/Cas9 基因编辑
原理
- Cas9：核酸内切酶，在 guide RNA（gRNA）引导下切割目标 DNA；
- gRNA：与目标 DNA 互补配对（约 20 nt）；
- 切割后通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）实现基因敲除或敲入。
优点
- 操作简单、效率高、可同时编辑多个基因；
- 2020 年诺贝尔化学奖授予 Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer Doudna。
9. RNA-seq
原理
- 提取 mRNA；
- 片段化；
- 反转录为 cDNA；
- 加接头、PCR 扩增；
- 高通量测序（如 Illumina）；
- 比对到参考基因组，定量基因表达。
应用
- 同时监测数千个基因的表达；
- 比较不同处理、不同发育阶段或不同疾病状态的转录组差异；
- 聚类分析（clustering）可发现共表达基因模块（如胆固醇合成、细胞周期、伤口愈合相关基因）。
十、模式生物（Model Organisms）
| 模式生物 | 研究优势 | 主要应用 |
|---|---|---|
| 病毒（viruses） | 结构简单、基因组小 | DNA/RNA/蛋白质合成、基因调控、癌症、基因治疗 |
| 细菌（bacteria） | 繁殖快、遗传操作方便 | DNA/RNA/蛋白质合成、代谢、抗生素靶点、细胞周期、信号转导 |
| 酵母（S. cerevisiae） | 真核生物、遗传操作成熟 | 细胞周期、蛋白质分泌、膜生物发生、细胞骨架、衰老、基因调控 |
| 线虫（C. elegans） | 细胞数目恒定、谱系清楚 | 体轴发育、细胞谱系、神经系统、程序性细胞死亡、衰老、行为 |
| 果蝇（D. melanogaster） | 遗传学经典、发育机制保守 | 体轴发育、细胞分化、神经系统、心脏、肌肉、程序性细胞死亡、癌症基因、行为 |
| 斑马鱼（D. rerio） | 脊椎动物、胚胎透明、体外发育 | 脊椎动物组织发育、脑和神经系统、出生缺陷、癌症 |
| 小鼠（M. musculus） | 哺乳动物、与人类亲缘近 | 组织发育、免疫系统、脑和神经系统、人类疾病模型、基因调控、传染病 |
| 拟南芥（A. thaliana） | 植物模式生物、基因组小 | 植物组织发育、细胞生物学遗传学、农业应用、生理、免疫 |
保守基因的例子
- Hox 基因：在果蝇和哺乳动物中均控制体轴发育；
- Pax6 / eyeless：果蝇的 eyeless 基因与哺乳动物的 Pax6 同源，均控制眼睛发育；人类 PAX6 突变导致无虹膜症（aniridia）。
意义： 模式生物研究表明，许多控制发育和细胞过程的基因在进化中高度保守，因此可以从简单生物的研究推及人类。
十一、本章关键点总结
| 主题 | 核心要点 |
|---|---|
| 光学显微镜 | 明场、相差、DIC、暗场；荧光显微镜；共聚焦排除焦外光；超分辨率（SIM、STORM） |
| 电子显微镜 | TEM 看内部超微结构；SEM 看表面形貌；冷冻蚀刻看膜内结构；cryo-EM 解析大分子结构 |
| 荧光探针 | GFP 标记蛋白；fura-2 检测 Ca²⁺；FACS 分选细胞 |
| 同位素 | \(^{32}\text{P}\) 标记核酸/ATP；\(^{35}\text{S}\) 标记蛋白；脉冲-追踪研究动态过程 |
| 细胞组分分离 | 差速离心按大小分离；密度梯度离心按密度分离；无细胞体系重建细胞过程 |
| 蛋白质纯化 | 凝胶过滤按大小；离子交换按电荷；亲和层析按特异结合；SDS-PAGE 按分子量 |
| 蛋白质检测 | Western blot 检测特定蛋白；质谱鉴定蛋白质 |
| 蛋白质互作 | GST pull-down（体外）、FRET（活细胞）、酵母双杂交（筛选）、噬菌体展示（筛选）、SPR（定量亲和力） |
| 基因功能研究 | 定点突变、RNAi 敲低、基因敲除/敲入、LoxP-Cre 条件敲除、CRISPR/Cas9 编辑、RNA-seq 转录组分析 |
| 模式生物 | 病毒、细菌、酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、拟南芥；基因功能高度保守 |
十二、复习自测题
- 比较明场、相差、DIC、暗场四种光学显微技术的原理和适用场景。
- 荧光显微镜的光路中，激发滤光片、二向色镜和发射滤光片各起什么作用？
- 共聚焦显微镜为什么能获得清晰的光学切片？它与普通荧光显微镜的关键区别是什么？
- TEM 和 SEM 的成像原理有何不同？各自适合观察什么结构？
- 冷冻蚀刻技术为什么能显示膜内蛋白颗粒？P 面和 E 面分别代表什么？
- 差速离心分离细胞器时，细胞核、线粒体、微粒体、核糖体分别在哪一级沉淀？
- 速度沉降和平衡沉降的区别是什么？各自根据什么物理量分离？
- 凝胶过滤、离子交换、亲和层析分别按什么原理分离蛋白质？哪一种纯度最高？
- SDS-PAGE 中 SDS 和巯基乙醇各起什么作用？蛋白质按什么顺序迁移？
- GST pull-down、FRET、酵母双杂交、噬菌体展示、SPR 各适合研究蛋白质互作的哪个方面？
- 基因敲除（knockout）和基因敲低（knockdown）有什么区别？各自常用什么方法实现？
- LoxP-Cre 系统如何实现组织特异性基因敲除？与全身敲除相比有什么优势？
- CRISPR/Cas9 的基本原理是什么？gRNA 和 Cas9 各起什么作用？
- 为什么模式生物的研究结果可以推及人类？请举一个保守基因的例子。
十三、解答
- 比较明场、相差、DIC、暗场四种光学显微技术的原理和适用场景。
· 明场 (Bright-field)：光直接透射过样品。对比度低，适合观察染色后的固定样品。 · 相差 (Phase-contrast)：将光通过透明样品产生的相位差转换为亮度差。适合观察未染色的活细胞内部结构。 · DIC (微分干涉)：利用偏振光分成两束相干光再干涉。呈现浮雕感（厚度差），适合观察活细胞动态。 · 暗场 (Dark-field)：只收集样品侧面散射的光。背景暗、样品亮，适合观察未染色的透明微小结构。
- 荧光显微镜的光路中，激发滤光片、二向色镜和发射滤光片各起什么作用？
· 激发滤光片 (Excitation filter)：只允许特定波长的激发光通过，阻挡其他波长。 · 二向色镜 (Dichroic mirror)：反射短波长的激发光至样品，透射长波长的发射光。 · 发射滤光片 (Emission filter)：只允许特定波长的发射荧光通过，彻底阻挡残余的激发光。
- 共聚焦显微镜为什么能获得清晰的光学切片？它与普通荧光显微镜的关键区别是什么？
· 原理：共聚焦显微镜在检测器前有一个针孔 (Pinhole)，只允许来自焦平面的光通过，阻挡了焦外上下层的杂散光。 · 关键区别：普通荧光显微镜收集整个深度的光导致图像模糊；共聚焦能进行逐层扫描（Z-stack），获得极薄的清晰光学切片，并可进行三维重建。
- TEM 和 SEM 的成像原理有何不同？各自适合观察什么结构？
· TEM (透射电镜)：电子束穿过超薄切片，电子密度高的区域散射电子呈暗区。适合观察细胞内部的超微结构。 · SEM (扫描电镜)：电子束扫描样品表面，收集二次电子成像。样品需喷镀金属。适合观察细胞或组织的表面 3D 形貌。
- 冷冻蚀刻技术为什么能显示膜内蛋白颗粒？P 面和 E 面分别代表什么？
· 原理：样品冷冻后用刀劈裂，断裂面往往沿着脂双层疏水核心（中间）裂开，从而暴露出嵌在膜内的蛋白颗粒。 · P 面 (Protoplasmic face)：靠近细胞质侧的内层小叶（含蛋白颗粒多）。 · E 面 (Ectoplasmic face)：靠近细胞外侧或内腔侧的外层小叶。
- 差速离心分离细胞器时，细胞核、线粒体、微粒体、核糖体分别在哪一级沉淀？
· 细胞核：最低转速（如 600g）。 · 线粒体：中等转速（如 15,000g）。 · 微粒体 (ER碎片)：较高转速（如 100,000g）。 · 核糖体：最高转速（如 300,000g）。
- 速度沉降和平衡沉降的区别是什么？各自根据什么物理量分离？
· 速度沉降：在较浅的梯度中，根据颗粒的大小和形状不同（沉降系数不同）进行分离。 · 平衡沉降：在陡峭的密度梯度中，颗粒下沉或上浮直到到达与其自身密度相等的位置悬浮。
- 凝胶过滤、离子交换、亲和层析分别按什么原理分离蛋白质？哪一种纯度最高？
· 凝胶过滤：按分子大小分离（大分子进不去孔，先洗脱）。 · 离子交换：按表面电荷差异分离。 · 亲和层析：按特异性生物相互作用（如抗原-抗体、酶-底物）分离。 · 纯度最高：亲和层析（通常作为最后一步纯化）。
- SDS-PAGE 中 SDS 和巯基乙醇各起什么作用？蛋白质按什么顺序迁移？
· SDS：使蛋白质变性，并赋予多肽链均匀的负电荷，消除了不同蛋白质之间的电荷差异。 · 巯基乙醇：还原并破坏二硫键，使蛋白质完全解折叠为线性多肽。 · 迁移顺序：按分子量大小分离，分子量越小的多肽在凝胶中迁移得越快（越靠下）。
- GST pull-down、FRET、酵母双杂交、噬菌体展示、SPR 各适合研究蛋白质互作的哪个方面？
· GST pull-down：体外验证或寻找与已知诱饵蛋白直接互作的蛋白。 · FRET：活细胞内实时监测蛋白-蛋白空间距离或互作。 · 酵母双杂交：活细胞内高通量筛选未知的互作蛋白（cDNA文库）。 · 噬菌体展示：高通量筛选特异性结合靶标的多肽或抗体。 · SPR (Biacore)：定量测定分子间的结合亲和力（K_d）及动力学常数（结合/解离速率）。
- 基因敲除（knockout）和基因敲低（knockdown）有什么区别？各自常用什么方法实现？
· Knockout (敲除)：通过DNA层面的改变，彻底破坏基因序列，导致蛋白完全不表达。常用方法：同源重组（ES细胞打靶）、CRISPR/Cas9。 · Knockdown (敲低)：在RNA或翻译层面抑制表达，降低蛋白水平但不清零。常用方法：RNA干扰（siRNA, shRNA）。
- LoxP-Cre 系统如何实现组织特异性基因敲除？与全身敲除相比有什么优势？
· 原理：将目标基因两侧装入 LoxP 位点（floxed 小鼠），与表达组织特异性启动子驱动的 Cre 重组酶转基因小鼠交配。Cre 酶只在特定组织中表达，从而仅切除该组织中的目标基因。 · 优势：避免全身敲除导致的胚胎致死；可研究特定成体组织或细胞中基因的功能。
- CRISPR/Cas9 的基本原理是什么？gRNA 和 Cas9 各起什么作用？
· 原理：利用细菌的获得性免疫机制进行基因编辑。 · gRNA (引导RNA)：识别并结合靶标 DNA 序列（通过碱基互补配对）。 · Cas9 (核酸内切酶)：在 gRNA 的引导下，在靶标 DNA 上产生双链断裂，诱发细胞进行非同源末端连接（NHEJ，导致敲除）或同源定向修复（HDR，用于敲入）。
- 为什么模式生物的研究结果可以推及人类？请举一个保守基因的例子。
· 原因：生命进化具有高度的保守性。许多控制基本细胞活动（如细胞周期、代谢）和早期发育的基因在真核生物乃至更广的物种间高度相似。 · 例子：Hox 基因在果蝇和哺乳动物中都控制体轴的发育；Pax6/eyeless 基因控制眼睛发育（果蝇 eyeless 与人类 PAX6 突变导致无虹膜症）。
参考文献与延伸阅读
- Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell, 7th Ed. W. W. Norton & Company, 2022.
- Lodish, H., et al. Molecular Cell Biology, 9th Ed. W. H. Freeman, 2021.
- 丁明孝、王喜忠、张传茂、陈建国 主编，《细胞生物学》（第五版），高等教育出版社，2020.
- 陈晔光、陈建国 主编，《细胞生物学》，高等教育出版社，2025.
- Rothman, J. E. (2014). The principle of membrane fusion in the cell (Nobel Lecture). Angewandte Chemie International Edition, 53(47), 12676–12694.
- Zhang, M., et al. (2020). A translocated channel for unconventional protein secretion. Cell, 182(4), 917–932.
说明： 侧重于每种方法“为什么这样设计”和“能解决什么问题”，具体操作步骤仅作简要说明。考试中若涉及方法选择，应从样品类型（活细胞/固定样品）、分辨率需求、是否需要标记、是否定量等角度分析。