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细胞生物学学习笔记 6 | 细胞内膜系统、蛋白质分选与膜泡运输

Chapter 6 课程复习笔记 | 区室化、蛋白质分选与共翻译转运、内质网与高尔基体功能、囊泡运输机制、胞吞与胞内体途径

细胞生物学学习笔记 6 | 细胞内膜系统、蛋白质分选与膜泡运输

对应课件： Lecture 4（Page 47–98）+ Lecture 5 (membrane trafficking 全篇)
本章核心内容： 细胞区室化与无膜细胞器、蛋白质分选途径、内质网与高尔基体的结构与功能、囊泡运输的分子机制与经典实验、胞吞与胞内体途径
复习目标： 掌握蛋白质分选信号与共翻译转运机制；理解内质网的质量控制与 UPR；掌握高尔基体的加工分选功能；熟悉囊泡运输的分子基础及胞吞途径的多样性。

一、细胞区室化与无膜细胞器

1. 膜包被区室（Membrane-enclosed Compartments）

真核细胞通过膜系统划分为不同区室，各具特定功能。肝细胞中各主要区室体积占比（参考 Lecture 5）：

  • 细胞质基质 (Cytosol)：54%
  • 线粒体 (Mitochondria)：22%
  • 粗面内质网腔：9%
  • 滑面内质网 + 高尔基体腔：6%
  • 细胞核：6%
  • 过氧化物酶体、溶酶体、内体各占 1%。

2. 无膜区室与液-液相分离 (Phase Separation)

  • 液-液相分离 (Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS)：细胞内的某些蛋白质和 RNA 可通过多价相互作用聚集成液滴状的无膜结构，如 P颗粒（P-granules）、核仁、应激颗粒等。
  • 生物学意义：富集特定分子、加速生化反应、调控信号转导。2023年生命科学突破奖授予了 Clifford P. Brangwynne 和 Anthony A. Hyman，以表彰他们在该领域的贡献。

二、蛋白质分选与跨膜转运机制

1. 蛋白质分选的三大途径

  1. 门控运输 (Gated transport)：通过核孔，进出细胞核（需 NLS/NES）。
  2. 跨膜运输 (Transmembrane transport)：通过膜上移位子 (Translocon)，进入 ER、线粒体、叶绿体、过氧化物酶体。
  3. 囊泡运输 (Vesicular transport)：通过囊泡出芽与融合，在 ER、高尔基体、质膜、内体、溶酶体之间穿梭。

2. 内质网的共翻译转运 (Cotranslational Translocation)

  • 信号假说 (Signal Hypothesis)：由 Günter Blobel 提出（1999诺奖），提出蛋白质的 N 端信号肽引导其进入 ER。
  • 过程：
    1. SRP (信号识别颗粒) 结合新生肽链的 ER 信号肽，暂停翻译。
    2. SRP 结合 ER 膜上的 SRP 受体。
    3. 核糖体与 Sec61 移位子对接，翻译恢复，新生肽链进入 ER 腔。
    4. 信号肽酶切除信号肽。
  • 跨膜蛋白的插入：
    • 单次跨膜：有可切除信号肽 + 内部停止转移序列（跨膜段）。
    • 多次跨膜：内部信号肽引导，跨膜段交替进行“停止-转移”。
    • 尾锚定蛋白 (Tail-anchored)：C 端跨膜段在翻译后由 Get3 识别并插入 ER。

三、内质网 (ER) 的结构与功能

  • 粗面内质网 (rER)：附着核糖体，负责分泌蛋白、膜蛋白的合成。
  • 滑面内质网 (sER)：管状网络，负责脂质合成、Ca²⁺ 储存（Ca²⁺-ATPase 泵入）、解毒（细胞色素 P450）、糖原分解（葡萄糖-6-磷酸酶）。
  • 微粒体 (Microsomes)：细胞匀浆后 ER 破碎形成的封闭囊泡，保留了 ER 的功能（如蛋白合成、糖基化），用于体外研究。

1. N-连接糖基化与质量监控 (Quality Control)

  • N-连接：连接于 Asn 的酰胺氮（序列 Asn-X-Ser/Thr），始于 ER。
  • O-连接：连接于 Ser/Thr 的羟基，始于高尔基体。
  • 多萜醇 (Dolichol)：脂质载体，在 ER 膜上组装核心寡糖，然后转移给新生肽链。
  • 质量监控 (ER Quality Control)：
    • 伴侣蛋白 BiP、Calnexin 识别未折叠/错误折叠的蛋白。
    • 葡萄糖转移酶 (Glucosyl-transferase) 监控并添加葡萄糖。
    • PDI (蛋白二硫键异构酶)：在 ER 的氧化环境中促进二硫键的形成和重排。
    • 只有正确折叠的蛋白才能离开 ER；错误折叠的蛋白通过 Retrotranslocon 逆向转运到胞质，被泛素化后由蛋白酶体降解（ERAD 途径）。

2. 未折叠蛋白反应 (UPR)

当 ER 中未折叠蛋白过多时，引发 UPR 以增加 ER 伴侣蛋白的合成，恢复稳态：

  1. IRE1（跨膜激酶）：自磷酸化，利用其内切核酸酶活性剪切 XBP1 mRNA，形成转录因子 XBP1s，入核激活伴侣基因。
  2. PERK：磷酸化 eIF2α，抑制全局翻译，减少新蛋白进入 ER。
  3. ATF6：转入高尔基体被切割，释放转录因子入核。

3. ER 驻留蛋白的回收 (KDEL Receptor)

  • ER 驻留蛋白具有 C 端 KDEL 序列。
  • 如果逃逸到高尔基体，KDEL 受体在高尔基体较低 pH 下与之结合，通过 COPI 囊泡将它们运回 ER。
  • 在 ER 较高 pH 下，KDEL 受体与蛋白分离。

4. 膜脂的合成与转位

  • 大部分膜脂在 ER 合成，插入脂双层胞质侧。
  • Scramblase（翻转酶，属于 ABC 转运蛋白家族）：在 ER 膜上无选择性地使脂质双向翻转，导致 ER 膜脂分布对称。
  • Flippase（翻转酶）：在质膜和高尔基体上，消耗 ATP 将特定脂质（如 PS、PE）单向翻转到胞质侧，维持膜的不对称性。

四、高尔基体 (Golgi Apparatus) 的结构与功能

  • 结构：由顺面 (cis)、中间面 (medial)、反面 (trans) 及反面高尔基体网络 (TGN) 组成。顺面靠近 ER，反面靠近质膜。
  • 区域差异（细胞化学反应）：
    • cis 面：嗜锇反应。
    • medial 面：NADP 酶（烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸酶）标志。
    • trans 面：TPP 酶（焦磷酸硫胺素酶）、CMP 酶。

1. 蛋白质的加工修饰

  • N-连接糖基化的修剪：切除甘露糖，添加 GlcNAc、半乳糖、唾液酸 (NANA) 等。
  • O-连接糖基化：在 Ser/Thr 上加 GalNAc。
  • 蛋白水解加工 (Proteolysis)：如胰岛素的成熟。在调节型分泌途径中，胰岛素原 (Proinsulin) 在分泌颗粒中被 PC2、PC3 等内切蛋白酶切割，产生有活性的胰岛素和 C肽。
  • 其他修饰：棕榈酰化（脂质修饰）、酪氨酸硫酸化等。

2. 高尔基体的成熟模型（两个假说）

  • 囊泡运输模型 (Vesicular Transport Model)：高尔基体膜囊是稳定的，货物通过囊泡在囊泡间顺向穿梭。
  • 囊膜成熟模型 (Cisternal Maturation Model)：被广泛接受。新的膜囊在顺面形成，整个膜囊逐渐向反面移动并成熟，同时顺向携带货物，逆向囊泡（COPI）将加工酶运回前一个膜囊。

3. 分泌途径 (Secretory Pathways)

  • 组成型分泌 (Constitutive Secretion)：无调节，持续不断将新合成的膜蛋白、脂质和分泌蛋白运送到质膜（如成纤维细胞分泌胶原）。
  • 调节型分泌 (Regulated Secretion)：专特化细胞（如内分泌、外分泌、神经元），分泌产物储存在分泌颗粒 (Secretory granules) 中，只有当细胞收到特定信号（如激素、神经递质、Ca²⁺ 内流）时才发生胞吐（如胰岛 β 细胞释放胰岛素）。
  • 分泌颗粒的浓缩机制：强电荷相互作用、分子间二硫键、强离子相互作用。

五、囊泡运输 (Vesicular Transport) 的机制与经典实验

1. 2013年诺贝尔生理学或医学奖

表彰 James E. Rothman, Randy W. Schekman 和 Thomas C. Südhof 在发现囊泡运输调节机制中的贡献。

  • Randy Schekman：利用酵母温度敏感突变体（sec 突变体）发现分泌途径被阻断（细胞内积累囊泡），鉴定出一系列 sec 基因。
  • James Rothman：利用无细胞体系 (Cell-free system) 重现高尔基体间的囊泡运输，发现了 SNARE 蛋白及融合机制。
  • Thomas Südhof：发现了神经元中响应钙离子触发囊泡融合的传感器蛋白（如 Synaptotagmin）。

2. 囊泡出芽与包被蛋白 (Coat Proteins)

  • COPII：介导 ER → 高尔基体的顺向运输。起始 G 蛋白为 Sar1。
  • COPI：介导高尔基体内部逆向运输（如回收 KDEL 受体、回收加工酶）以及高尔基体 → ER 的逆向运输。起始 G 蛋白为 ARF。
  • Clathrin（网格蛋白）：介导 TGN → 内体/溶酶体，以及质膜的内吞。呈三曲臂状 (triskelion)。切离需要 Dynamin（发动蛋白，GTP酶）。

3. 囊泡的锚定与融合

  • Rab 蛋白：GTP 酶，提供靶向特异性，促进囊泡与靶膜的锚定 (tethering)。
  • SNARE 复合体：v-SNARE（囊泡上）与 t-SNARE（靶膜上）拉链式配对，拉近两层膜促发融合。融合后由 NSF（含 ATPase 活性）和 α-SNAP 解开 SNARE 复合体循环利用。

六、胞吞作用 (Endocytosis) 与胞内体途径

1. 胞吞的类型

  • 吞噬作用 (Phagocytosis)：摄取大颗粒（>1 μm，如细菌、细胞碎片），依赖肌动蛋白聚合形成伪足，仅限于专职吞噬细胞（巨噬细胞、中性粒细胞）。
  • 胞饮作用 (Pinocytosis)：摄取液体和溶质。
    • 巨胞饮 (Macropinocytosis)：非特异性，形成大的巨胞饮体 (Macropinosome)。
    • 网格蛋白介导的胞吞 (Clathrin-mediated endocytosis)：受体介导，形成 ~120 nm 的包被小窝。
    • 胞膜窖介导的胞吞 (Caveolin-mediated endocytosis)：形成 ~80 nm 的窖 (Caveolae)，参与跨内皮细胞运输 (Transcytosis) 和信号传导。
    • 非网格蛋白/窖不依赖途径 (CLIC/GEEC)、Flotillin 依赖途径等。

2. 受体介导的胞吞 (Receptor-Mediated Endocytosis, RME)

  • 经典模型：LDL（低密度脂蛋白）摄取与胆固醇代谢。
    • LDL 结合细胞膜上的 LDL 受体 → 受体聚集在网格蛋白包被小窝 (Coated pit) → Dynamin 切断形成包被囊泡 → 脱被 → 与早期内体融合。
    • 内体低 pH (pH~5.0) 导致 LDL 与受体分离 → 受体通过回收内体回到质膜，LDL 运往溶酶体降解释放游离胆固醇。
    • 家族性高胆固醇血症 (Familial Hypercholesterolemia)：LDL 受体突变导致无法摄取 LDL，血液胆固醇升高，引发动脉粥样硬化。（Brown & Goldstein 1985诺奖）
  • 转铁蛋白循环 (Transferrin cycle)：铁结合转铁蛋白在质膜中性 pH 下结合受体被内吞；在早期内体低 pH 下释放铁离子；脱铁转铁蛋白 (Apotransferrin) 与受体复合物回到质膜，中性 pH 下释放。

3. 胞内体 (Endosomes) 的分选与命运

  • 早期内体 (Early Endosome)：管状网络，负责分选。
  • 内吞受体的三种命运：
    1. 回收 (Recycling)：回到质膜（如 LDL 受体、转铁蛋白受体）。部分蛋白储存在回收内体中（如 Glut4 储存囊泡，受胰岛素刺激后移位到质膜）。
    2. 降解 (Degradation)：进入晚期内体 (Late Endosome / Multivesicular Body, MVB)，最终与溶酶体融合被水解。
    3. 转胞吞作用 (Transcytosis)：跨过上皮细胞。如新生儿肠道上皮细胞通过 Fc 受体将母体 IgG 从肠腔转运到血液。

4. 多囊泡体 (MVB) 与外泌体 (Exosome)

  • MVB 的形成：早期内体膜向内出芽，形成包含小囊泡的腔室。涉及 ESCRT 复合体（识别泛素化受体，如 EGFR）。
  • 外泌体：当 MVB 与质膜融合时，内部的小囊泡被释放到细胞外，称为外泌体，是细胞间通讯的重要载体。

5. 上皮细胞的极性维持 (Polarity)

  • 直接分选：TGN 直接产生不同的囊泡，分别运往顶端膜 (Apical) 和基底外侧膜 (Basolateral)。
  • 间接分选：TGN 产生的囊泡先运往基底外侧膜，然后通过内吞和转胞吞作用运往顶端膜。

复习自测提示

1. ER 的共翻译转运与翻译后转运的区别？信号肽、SRP、Sec61 的功能。

  • 区别：共翻译转运是指蛋白质在核糖体上边合成边进入内质网腔（主要途径）；翻译后转运是指蛋白质在胞质中完全合成后，再通过分子伴侣（如 Hsp70）解折叠并运送入细胞器（如线粒体、叶绿体或 ER 的尾锚定蛋白）。
  • 信号肽：多肽链 N 端的 15-30 个氨基酸序列，引导核糖体到 ER 膜上，进入 ER 后被信号肽酶切除。
  • SRP（信号识别颗粒）：结合信号肽，暂停翻译，并将核糖体引导至 ER 膜上的 SRP 受体。
  • Sec61：ER 膜上的移位子（Translocon）通道，新生肽链通过它进入 ER 腔或侧向插入脂双层。

2. 内质网的质量监控 (QC) 和 UPR 的机制。KDEL 回收的机制。

  • QC 机制：伴侣蛋白（如 BiP、Calnexin）和 PDI 帮助蛋白质折叠；若最终折叠错误，通过 Retrotranslocon 逆向转运至胞质，经泛素化后被蛋白酶体降解（ERAD）。
  • UPR 机制：ER 中未折叠蛋白过多时，激活三条感应通路：IRE1（剪接 XBP1 mRNA 入核）、PERK（磷酸化 eIF2α 抑制全局翻译）、ATF6（入高尔基体切割后入核），以增加 ER 伴侣蛋白表达，恢复稳态。
  • KDEL 回收：ER 驻留蛋白 C 端带有 KDEL 序列。逃逸至高尔基体后，在较低 pH 下与 KDEL 受体结合，通过 COPI 囊泡运回 ER；在 ER 较高 pH 下释放。

3. 高尔基体的膜囊成熟模型和囊泡运输模型的异同。

  • 囊泡运输模型：高尔基体的膜囊是稳定静止的，货物靠囊泡在膜囊间顺向穿梭运输。
  • 膜囊成熟模型（主流）：高尔基体膜囊本身在移动并逐渐成熟。新的膜囊在 cis 面形成，逐渐向 trans 面移动，同时顺向携带货物，逆向囊泡（COPI）将加工酶运回前一层膜囊。
  • 相同点：都承认存在物质的定向运输和加工酶的分布差异。不同点：膜囊本身是否在移动和演变。

4. 调节型分泌和组成型分泌的区别；胰岛素原的加工过程。

  • 组成型分泌：所有细胞均有，无调节、持续不断地将新合成的蛋白质和脂质运送至质膜。
  • 调节型分泌：特化细胞（如内分泌细胞），蛋白质储存在分泌颗粒中，只有在收到特定信号（如 Ca²⁺ 内流）时才发生胞吐。
  • 胰岛素原加工：在 TGN 处被分选进入未成熟的分泌颗粒。在颗粒成熟过程中，胰岛素原被 PC2、PC3 等内切蛋白酶切割，产生有活性的胰岛素和 C 肽，并在酸性环境和锌离子参与下形成致密核心沉淀。

5. 囊泡出芽的三种包被蛋白 (COPII, COPI, Clathrin) 的功能及它们的作用位置。

  • COPII：介导 ER → 高尔基体的顺向运输。起始蛋白为 Sar1。
  • COPI：介导高尔基体内部（反→顺）及高尔基体 → ER 的逆向运输（如回收 KDEL 受体和加工酶）。起始蛋白为 ARF。
  • Clathrin（网格蛋白）：介导 TGN → 内体/溶酶体，以及质膜的内吞。囊泡颈部的切离需要 Dynamin（发动蛋白）。

6. Schekman 和 Rothman 的经典实验分别证明了什么？

  • Schekman：利用酵母温度敏感突变体（sec 突变体），证明分泌途径是由一系列特定基因（sec 基因）调控的，突变会导致囊泡在细胞内积累。
  • Rothman：利用体外无细胞体系（Cell-free system）重现高尔基体间的囊泡运输，证明了囊泡融合需要特定的膜蛋白，发现了 SNARE 复合体及融合机制。

7. 受体介导的胞吞（如 LDL 和转铁蛋白）过程，及受体在内体中的分选命运。

  • LDL 过程：LDL 结合受体后在网格蛋白小窝内吞；早期内体低 pH 导致 LDL 与受体分离；受体回收至质膜，LDL 送入溶酶体释放游离胆固醇。
  • 转铁蛋白过程：铁结合转铁蛋白在中性 pH 下结合受体内吞；内体低 pH 下释放铁离子；脱铁转铁蛋白-受体复合物回收至质膜，在中性 pH 下释放。
  • 受体命运：① 回收（Recycling，如 LDL 受体）；② 降解（Degradation，进入 MVB/溶酶体）；③ 转胞吞（Transcytosis）。

8. 什么是转胞吞作用 (Transcytosis)？举例说明。

  • 定义：大分子或颗粒通过受体介导的内吞进入细胞一侧，穿越细胞质后，从质膜的另一侧通过胞吐释放出去的过程。
  • 例子：新生儿肠道上皮细胞通过表面的 Fc 受体，将母乳中的母体 IgG 从肠腔摄取，跨越上皮细胞转运到血液中，为新生儿提供被动免疫。

9. 多囊泡体 (MVB) 和 ESCRT 复合体的功能，以及外泌体的来源。

  • MVB：晚期内体，形态上包含许多内部小囊泡，负责将泛素化的膜蛋白和脂质分选进入内部小囊泡，最终送往溶酶体降解。
  • ESCRT 复合体：负责识别带有泛素标签的货物受体，并驱动内体膜向内出芽，形成 MVB 的内部小囊泡。
  • 外泌体来源：当 MVB 与质膜融合时，它内部的小囊泡被释放到细胞外，这些释放出的小囊泡即为外泌体，可用于细胞间通讯。
  1. 什么是转胞吞作用 (Transcytosis)？举例说明。
  2. 多囊泡体 (MVB) 和 ESCRT 复合体的功能，以及外泌体的来源。