Cell Biology on SHY's LAND

细胞生物学学习笔记 8 | 溶酶体、自噬与囊泡运输的分子机制

Mon, 02 Nov 2026 00:00:00 +0000

细胞生物学学习笔记 8 | 溶酶体、自噬与囊泡运输的分子机制

对应课件： Lecture 6 - Vesicle 2026
本章核心内容： 溶酶体的结构动态与 M6P 分选途径、溶酶体相关疾病、自噬的分类与分子机制（宏自噬、线粒体自噬）、囊泡运输的基本步骤（包被蛋白、Rab、SNARE、马达蛋白）、非经典分泌途径
复习目标： 掌握溶酶体酶的 M6P 靶向机制及 I-细胞病原理；理解自噬的核心步骤及 LC3 脂化过程；掌握囊泡定向运输与融合的分子机制；了解非经典分泌的主要类型。

一、溶酶体 (Lysosomes)

溶酶体是细胞内负责降解大分子物质的单层膜细胞器，含有大量酸性水解酶，标志酶为酸性磷酸酶 (acid phosphatase)。其形态和内容物具有高度的异质性 (Heterogeneous) 和动态变化。

1. 溶酶体的膜结构特征

V 型质子泵 (V-type H⁺-ATPase)：消耗 ATP 将 H⁺ 泵入溶酶体，维持腔内酸性环境 (pH ~ 5.0)，以激活酸性水解酶。
高度糖基化的膜蛋白：如 LAMP1/2，保护溶酶体膜免受自身水解酶的消化。
转运蛋白：将降解产物（如氨基酸、单糖）转运至细胞质供细胞再利用。

2. 溶酶体酶的分选与生物发生：M6P 途径

溶酶体蛋白在粗面内质网合成后，必须被精准靶向到溶酶体：

M6P 标记生成：在顺面高尔基体 (cis-Golgi) 中，溶酶体水解酶上的甘露糖残基被 GlcNAc 磷酸转移酶 (GlcNAc phosphotransferase) 识别，加上磷酸基团，随后切去 GlcNAc，暴露出甘露糖-6-磷酸 (M6P)。
受体结合：在反面高尔基体网络 (TGN)，M6P 标签被 M6P 受体识别。
网格蛋白包被：受体-货物复合物聚集在网格蛋白包被小窝中，出芽形成运输囊泡。
解离与回收：囊泡与晚期内体融合，低 pH 环境使 M6P 与受体分离，受体通过 COPI 囊泡回收至 TGN。

3. 溶酶体的功能

消化中心：降解大分子、吞噬体 (Phagosome) 和自噬体 (Autophagosome)。
分泌功能（胞吐）：如破骨细胞 (Osteoclasts) 分泌水解酶和 H⁺ 进行骨吸收；中性粒细胞在炎症时释放水解酶。
质膜修复：溶酶体与受损质膜融合，提供膜脂补丁。
信号枢纽：表面偶联 mTOR（感应营养充足）和 AMPK（感应能量匮乏）信号。

4. 溶酶体相关疾病

自溶作用 (Autolysis) / 硅肺 (Silicosis)：吸入的二氧化硅颗粒被巨噬细胞吞噬后破坏溶酶体膜，导致水解酶泄漏引起细胞死亡，并释放致纤维化因子。
I-细胞病 (I-cell disease / 粘脂贮积症 II 型)：GNPTA 基因突变导致 GlcNAc 磷酸转移酶缺失，溶酶体酶无法加上 M6P 标签，被默认分泌到血液中。导致溶酶体内缺乏水解酶，大量底物堆积形成包涵体。
Tay-Sachs 病 (家族黑蒙性痴呆)：己糖胺酶 A 缺乏，神经节苷脂 (Gangliosides) 在神经元中大量积累，导致精神呆滞和幼年夭折。

二、自噬 (Autophagy)

自噬是真核细胞通过双层膜结构包裹自身细胞质成分（如受损细胞器、蛋白聚集体），送至溶酶体降解的过程。大隅良典因发现自噬机制获 2016 诺贝尔奖（通过酵母 ATG 突变体筛选）。

1. 自噬的分类

巨自噬 (Macroautophagy)：形成双膜的自噬体，是最主要的形式。
微自噬 (Microautophagy)：溶酶体膜直接内陷吞噬货物。
分子伴侣介导的自噬 (CMA)：底物（含 KFERQ 序列）通过 HSC70 结合，直接通过 LAMP2A 转运入溶酶体。

2. 巨自噬的步骤与分子机制

诱导 (Induction)：饥饿或应激导致 mTOR 被抑制，AMPK 激活，进而激活 ULK1 复合体，启动吞噬泡形成。
成核与延伸 (Nucleation & Elongation)：在 ER 等膜结构上形成隔离膜 (Phagophore)，依赖 PI3K 复合体（产生 PI3P）和 ATG 家族蛋白。
LC3 脂化：延伸过程中，胞质中的 LC3-I 在 Atg7 (E1)、Atg3 (E2) 和 Atg5-Atg12-Atg16L (类似 E3) 的作用下，共价结合到磷脂酰乙醇胺 (PE) 上，形成 LC3-II，锚定在自噬体膜上。
闭合与融合：自噬体闭合，与溶酶体融合形成自噬溶酶体，由水解酶降解。

3. 选择性自噬 (Selective Autophagy)

底物通过受体蛋白（如 p62）识别泛素化标签，受体再通过 LIR 结构域与 LC3 结合，将底物特异性地包裹进自噬体。

线粒体自噬 (Mitophagy)：
- 泛素依赖途径：去极化的线粒体累积 PINK1，招募 Parkin (E3 酶)，使线粒体外膜蛋白泛素化，被 p62 等受体识别。
- 泛素非依赖途径：线粒体表面的 Nix、BNIP3、FUNDC1 等受体直接与 LC3 结合。
蛋白聚集体自噬：液态凝聚体（经 p62 识别）、胶态（SEPA-1）和固态（CCT2 介导）均可通过自噬降解，异常会导致阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病。

4. 自噬的功能

提供能量（细胞存活）、质量控制（清除受损细胞器）、清除胞内病原体、参与细胞分化与抗原递呈。过度自噬也可诱导细胞死亡（自噬性细胞死亡）。

三、囊泡运输 (Vesicular Transport)

囊泡运输是内膜系统物质交流的基础。基本步骤包括：出芽 (Budding) → 脱被 (Uncoating) → 运输 (Transport) → 锚定 (Docking) → 融合 (Fusion)。

1. 囊泡的包被蛋白 (Coat Proteins)

囊泡类型	包被蛋白	小 GTP 酶	运输方向
COP II	Sec23/24, Sec13/31	Sar1	ER → 高尔基体（顺向）
COP I	COPI 亚基复合体	ARF	高尔基体内部及高尔基体 → ER（逆向）
Clathrin	网格蛋白 + 接头蛋白 (AP2, AP1)	ARF	TGN → 内体/溶酶体；质膜 → 内体（内吞）

COP I 识别信号：负责回收逃逸的 ER 蛋白，如可溶蛋白的 KDEL 序列和膜蛋白的 KKXX 序列。
Dynamin（发动蛋白）：一种 GTP 酶，负责在网格蛋白囊泡颈部收缩，使其从质膜上切断。

2. 囊泡的定向运输：马达蛋白 (Motor Proteins)

囊泡沿微管 (Microtubules) 运输：

Kinesin（驱动蛋白）：向微管的 (+) 极 移动（通常朝向细胞外周），介导顺向运输。
Dynein（动力蛋白）：向微管的 (-) 极 移动（通常朝向细胞中心），介导逆向运输。

3. 囊泡的锚定与融合：Rab 与 SNARE

Rab 蛋白：小 GTP 酶家族（分子开关）。结合 GTP 时，其脂质基团暴露并插入膜中，负责将囊泡精确引导至靶膜并进行锚定 (Tethering)。受 GEF（激活）和 GAP（失活）调控。
SNARE 复合体：
- v-SNARE（囊泡膜上）与 t-SNARE（靶膜上）通过拉链式缠绕形成紧密的四螺旋束，克服水合排斥力，驱动两层膜融合。
- 融合后，NSF（一种 ATP 酶）利用 ATP 水解的能量解开 SNARE 复合体，实现循环利用。

四、非经典分泌 (Unconventional Secretion)

无信号肽的蛋白质（如炎症因子、生长因子）不经过 ER-高尔基体途径的分泌方式。主要有四种类型：

I 型：直接跨质膜转运。如 FGF2 通过 ATP1A1 和 Tec 激酶介导；THU 途径（HSP90A 协助货物去折叠，通过 TMED10 通道转运）。
II 型：利用 ABC 转运蛋白跨膜。
III 型：利用跨膜载体或膜翻转。
IV 型：依赖自噬/溶酶体途径。如无前导序列的 IL-1β 通过 GSDMD 孔直接释放；或进入多泡体 (MVB) 释放。
CMA (分子伴侣介导的自噬)：含 KFERQ 序列的蛋白通过 HSC70 进入溶酶体。
MAPS (错误折叠蛋白分泌)：错误折叠蛋白通过 USP19、DNAJC5 等转运至细胞膜分泌。

五、本章关键点总结

主题	核心要点
溶酶体	酸性水解酶；V 型泵维持 pH 5.0；膜蛋白高度糖基化防自溶。
M6P 途径	溶酶体酶在高尔基体被 GlcNAc 磷酸转移酶修饰为 M6P，由 M6P 受体分选至溶酶体。
相关疾病	I-细胞病（GNPTA 突变，M6P 标记失败）；Tay-Sachs（酶缺乏导致脂质堆积）；硅肺（溶酶体破裂）。
自噬	巨自噬、微自噬、CMA。巨自噬受 mTOR/AMPK 调节，依赖 ATG 基因。LC3-II 是自噬体标志。
选择性自噬	泛素化货物由 p62 等受体（LIR 结构域）识别；线粒体自噬由 PINK1/Parkin 或 Nix 介导。
囊泡出芽	COPII (ER→Golgi), COPI (Golgi 内部/回收), Clathrin (内吞/TGN)。Dynamin 负责切断。
靶向与融合	马达蛋白 (Kinesin 顺向，Dynein 逆向)；Rab 负责锚定；SNARE (v/t) 负责融合，NSF 负责解离。
非经典分泌	I 型 (TMED10, GSDMD)，IV 型 (自噬途径)，CMA (LAMP2A)。

六、复习自测题

简述溶酶体膜的三个主要特征，以及它们对溶酶体功能的必要性。
M6P 标签是如何生成的？M6P 受体为什么在溶酶体内部释放酶？I-细胞病的发病机制是什么？
自噬有哪三种类型？简述巨自噬（宏自噬）的基本过程。
LC3-II 是如何形成的？它在自噬过程中的作用是什么？
p62 受体如何介导线粒体或蛋白聚集体进入自噬体？
比较 COPII、COPI 和网格蛋白包被囊泡的组成、运输方向和功能。
Rab 蛋白和 SNARE 蛋白在囊泡融合中分别起什么作用？
驱动蛋白 (Kinesin) 和动力蛋白 (Dynein) 在囊泡运输中的区别是什么？
什么是非经典分泌？请列举至少三种非经典分泌的途径及代表蛋白。

细胞生物学学习笔记 7 | 线粒体与叶绿体：能量转换与内共生

Wed, 28 Oct 2026 00:00:00 +0000

细胞生物学学习笔记 7 | 线粒体与叶绿体：能量转换与内共生

对应课件： Mitochondria & Chloroplast-2026
本章核心内容： 线粒体与叶绿体的结构、动力学、内共生假说、线粒体能量代谢（TCA循环、电子传递链、化学渗透、ATP合酶）、代谢调控、线粒体基因与炎症、细胞凋亡与信号、光合作用（光反应与暗反应）
复习目标： 掌握线粒体与叶绿体在结构上的异同（膜层数）；理解内共生学说的主要证据；掌握电子传递链和化学渗透学说的核心原理；理解 ATP 合酶的工作机制；了解线粒体 mtDNA 的遗传特征及 cGAS-STING 炎症通路；对比线粒体与叶绿体的能量转换机制。

一、线粒体与叶绿体的结构与动力学

1. 结构的异同（核心考点）

特征	细菌 (Bacterium)	线粒体 (Mitochondrion)	叶绿体 (Chloroplast)
膜的层数	2层	2层	3层（外膜、内膜、类囊体膜）
产能部位	内膜	嵴 (Cristae)	类囊体 (Thylakoid)
能量转换	代谢物分解	产能（代谢物分解）、产生 CO₂	产能（光能驱动）、合成糖、释放 O₂

线粒体结构：

外膜 (Outer membrane)、膜间隙 (Intermembrane space)、内膜 (Inner membrane)、基质 (Matrix)。
嵴 (Cristae)：内膜内卷形成，目的是增加工作面积，是电子传递和 ATP 合成的场所。

2. 线粒体动力学 (Dynamics) 与分布

线粒体形态丰富，根据细胞能量需求不断进行融合 (Fusion) 和 分裂 (Fission)。
调控机制：由 GTP（而非 ATP）调控。
融合与分裂的意义：
- 融合：给不含 mtDNA 的线粒体补充 mtDNA 及其产物（混匀效应）。
- 分裂：辅助线粒体质量控制（如自噬）、运输、凋亡、细胞分裂时的线粒体分配。
毒素影响：CCCP（线粒体毒素）诱导分裂。
分布：通常散布于细胞质，但在肌肉、精子等特殊细胞中有特定的空间分布 pattern。

二、内共生假说 (Endosymbiosis)

线粒体和叶绿体都起源于细菌祖先。 为什么说线粒体先于叶绿体完成内共生？

大多数真核生物（包括植物、动物、真菌）都有线粒体，而只有植物和藻类有叶绿体。
线粒体来源于 α-变形菌，叶绿体来源于蓝细菌。

内共生学说的主要证据

基因转移：>99% 的线粒体蛋白通过基因转移，由核基因编码。线粒体基因组仅编码 13 个蛋白（高度疏水、多重跨膜，如 ETC 复合物亚基）。
原核特征保留：
- 部分核编码的线粒体蛋白（如 RNA 聚合酶、核糖体）携带原核特征。
- 线粒体基因编码的蛋白携带 N-formyl-methionine（N-甲酰甲硫氨酸）原核特征。
心磷脂 (Cardiolipin)：线粒体内膜与细菌内膜共有，参与调节蛋白复合物活性及内膜曲率。
抗生素敏感性：线粒体拥有原核特征，部分抗生素（如喹诺酮、氨基糖苷、β-内酰胺类、氯霉素）具有线粒体毒性。

三、线粒体能量代谢（核心重点）

1. 氧化磷酸化 (Oxidative Phosphorylation)

定义：代谢物氧化释放的能量，通过电子传递链驱动质子泵送，建立跨膜质子梯度，进而驱动 ATP 合成的过程。

化学渗透学说 (Chemiosmotic theory)：由 Peter Mitchell 提出（1978 诺贝尔化学奖）。

2. 电子传递链 (ETC) 与质子泵

电子传递路径：NADH → 复合物 I (Complex I) → CoQ → 复合物 III → Cyt c → 复合物 IV → O₂。
或 Succinate → 复合物 II (Complex II) → CoQ…
质子泵送：
- 复合物 I, III, IV 具有质子泵功能，将 H⁺ 从基质 (Matrix) 泵入膜间隙。
- 复合物 II 不能泵出 H⁺。
能量计算：
- 氧化 1 分子 NADH 驱动 10 个 H⁺ 转运 (I:4 + III:4 + IV:2) → 生成 2.5 ATP。
- 氧化 1 分子 FADH₂ 驱动 6 个 H⁺ 转运 (III:4 + IV:2) → 生成 1.5 ATP。
胞质 NADH 的穿梭机制：
- 苹果酸-天冬氨酸穿梭：将胞质 NADH 完整转入线粒体基质，氧化可泵 10 个 H⁺。
- 甘油-3-磷酸穿梭：电子跳过复合物 I，直接给 CoQ，氧化只泵 6 个 H⁺。

3. ATP 合酶 (ATP Synthase)

结构：F₀（转子 ring，嵌入膜内，含 c 亚基）和 F₁（催化头部，含 α、β、γ 亚基）。
工作机制：旋转催化。
- H⁺ 顺浓度梯度穿过 F₀，推动 C-ring 旋转。
- 转子 stalk (γ 亚基) 随之旋转，搅动 F₁ 头部，引起构象改变。
- 构象变化驱动 ADP + Pi 合成 ATP（Open → Loose → Tight 状态循环）。
双向性：既可在 H⁺ 梯度驱动下合成 ATP，也可水解 ATP 制造 H⁺ 梯度（如溶酶体 V 型质子泵）。
消耗比：合成 1 个 ATP 理论消耗约 3.7 个 H⁺，实验实测约 4 个（人类转子有 8 个亚基）。
晶体学证明：Paul Boyer 和 John Walker 通过实验（附着荧光肌动蛋白纤维）直接观察到旋转现象，获 1997 诺贝尔化学奖。

4. 结构优化与解偶联

嵴的作用：ATP 合酶二聚体弯曲膜形成嵴，将质子泵集中，提高 ATP 合成效率。
解偶联 (Uncoupling)：
- 生理性：棕色脂肪细胞 (BAT) 中的 UCP1（解偶联蛋白 1），受冷刺激和去甲肾上腺素调控，H⁺ 通过 UCP1 漏回基质，不经过 ATP 合酶，能量直接以热能释放。
- 化学性：DNP (2,4-二硝基苯酚)，曾用于减肥，但会导致体温过高甚至死亡。

四、代谢调控与 TCA 循环

1. 三羧酸循环 (TCA / Krebs cycle)

功能：不仅氧化乙酰辅酶 A 产生 NADH 和 FADH₂，还是代谢中转站。
调控：受底物（NAD⁺, ADP）激活，受产物（NADH, ATP）抑制。
Ca²⁺ 兴奋-代谢偶联：神经传递、肌肉收缩时释放 Ca²⁺，Ca²⁺ 进入线粒体，激活 TCA 循环，同步增加 ATP 产量以满足能量需求。
转脂原理：碳水（葡萄糖）代谢产生柠檬酸，出线粒体后由 ACLY 酶转为乙酰辅酶 A；瘦肉（氨基酸）代谢也会产生乙酰辅酶 A，两者均可作为脂肪酸合成的前体。

五、线粒体基因组与炎症

1. 线粒体基因组 (mtDNA)

人类 mtDNA 编码 13 个 OXPHOS 亚基 + 22 个 tRNA + 2 个 rRNA。
半自主性：约 1200 个核基因编码蛋白服务于线粒体。
母系遗传：每个细胞有 500-100,000 个 mtDNA 拷贝。存在异质性 (Heteroplasmy)，突变比例不同会导致不同程度的后代症状（阈值效应）。
三亲婴儿：通过线粒体置换技术（将母亲卵子的细胞核转移到健康供体卵子中），避免母系遗传的线粒体疾病。

2. 线粒体与炎症 (2024 Lasker 奖)

cGAS-STING 通路：细胞质中通常没有 DNA。当线粒体损伤、mtDNA 突变或感染时，mtDNA 释放到细胞质。mtDNA 是强烈的免疫激动剂，被 cGAS 识别，生成 cGAMP，激活 STING，最终诱导 I 型干扰素 (IFN) 产生炎症反应。（James Chen 杰出贡献）

六、线粒体信号与细胞凋亡

1. 细胞凋亡 (Apoptosis) 途径

线粒体不仅是细胞工厂，还决定细胞命运。
内在通路：细胞应激导致 Bcl-2 家族蛋白（Bax/Bak）激活 → 线粒体外膜透化 (MOMP) → 细胞色素 c (Cytochrome c) 释放入胞质 → 与 Apaf-1、Caspase-9 结合形成凋亡体 (Apoptosome) → 激活 Caspase-3/7 执行凋亡。（王晓东院士的经典发现，1996）

2. 线粒体信号网络

释放 Cyt c（死亡）、H₂O₂（氧化还原）、AMPK（代谢）、mtDNA（免疫）、TCA 代谢物（表观遗传修饰）等。

七、叶绿体与光合作用

1. 结构

外膜、内膜、类囊体膜（3层膜）。类囊体膜上发生光反应，基质 (Stroma) 发生暗反应（固碳）。

2. 光反应 (Light Reactions)

光系统：光捕获复合物 + 反应中心。有 PSII（吸收 680 nm）和 PSI（吸收 700 nm）。
电子传递：光系统 II 光解水（产生 O₂ 和 H⁺）启动电子传递 → 质体醌 → 细胞色素 b6f 复合体（泵 H⁺）→ 质体蓝素 → 光系统 I（二次充能）→ 铁氧还蛋白 → 产生 NADPH。
相似性：光系统 II 和细胞色素 b6f 泵送 H⁺，建立跨膜质子梯度，驱动 ATP 合酶合成 ATP（类似线粒体）。

3. 暗反应 (Dark Reactions / 卡尔文循环)

虽然叫暗反应，但不需要光，而非只在黑暗中发生。
三个阶段：
1. 固碳 (Fixation)：Rubisco 催化 CO₂ 与二磷酸核酮糖 (RuBP) 结合。
2. 还原 (Reduction)：消耗光反应产生的 ATP 和 NADPH，将 3-磷酸甘油酸还原为甘油醛-3-磷酸 (G3P)。
3. RuBP 再生 (Regeneration)。
总反应：3 CO₂ + 6 NADPH + 9 ATP → G3P 等。

4. 原核光合作用与光遗传学

无氧光合作用：紫菌、绿菌。
视紫红质光合作用：古菌 (Archaea)。
光遗传学 (Optogenetics)：将光敏离子通道（如 Channelrhodopsin-2, NpHR）转入神经元，用光精确控制神经元电活动。（Karl Deisseroth 等发展）

八、本章关键点总结

主题	核心要点
结构对比	线粒体 2 层膜（内膜内折形成嵴）；叶绿体 3 层膜（类囊体膜）。
动力学	由 GTP 调控融合与分裂。融合互补 mtDNA，分裂辅助自噬分配。
内共生证据	基因转移（依赖核基因）、原核特征（N-甲酰甲硫氨酸）、心磷脂、抗生素敏感。
能量代谢	ETC 将 H⁺ 泵出内膜；ATP 合酶利用 H⁺ 梯度旋转催化合成 ATP。
TCA 循环	受 Ca²⁺ 促进（兴奋-代谢偶联）；作为代谢中转站。
mtDNA	母系遗传，半自主性（编码 13 个蛋白），多拷贝异质性。
免疫与凋亡	释放胞质激活 cGAS-STING 炎症通路；释放细胞色素 c 激活 Caspase 引发凋亡。
光合作用	光反应（PSII 与 PSI 电子传递，产 O₂、ATP、NADPH）；暗反应（卡尔文循环固碳）。

九、复习自测题

列表比较线粒体与叶绿体在结构、能量转换部位和功能上的异同。
线粒体的融合和分裂分别有什么生理意义？受什么分子调控？
内共生学说的主要证据有哪些？为什么线粒体先于叶绿体完成内共生？
简述电子传递链中复合物 I、II、III、IV 的电子传递顺序和质子泵送情况。
为什么氧化一分子 NADH 产生 2.5 个 ATP，而一分子 FADH₂ 产生 1.5 个 ATP？
简述 ATP 合酶的旋转催化机制和双向性。
棕色脂肪细胞如何产热？UCP1 的作用机制是什么？
什么是 Ca²⁺ 兴奋-代谢偶联？
人类 mtDNA 有哪些特征（遗传方式、编码产物、异质性）？
细胞色素 c 释放如何引发细胞凋亡？
cGAS-STING 通路是如何被 mtDNA 激活并引发炎症的？
简述光系统 II 和光系统 I 在光反应中的功能。
卡尔文循环分为哪三个阶段？需要消耗哪些光反应产物？

细胞生物学学习笔记 6 | 细胞内膜系统、蛋白质分选与膜泡运输

Wed, 21 Oct 2026 01:01:00 +0000

细胞生物学学习笔记 6 | 细胞内膜系统、蛋白质分选与膜泡运输

对应课件： Lecture 4（Page 47–98）+ Lecture 5 (membrane trafficking 全篇)
本章核心内容： 细胞区室化与无膜细胞器、蛋白质分选途径、内质网与高尔基体的结构与功能、囊泡运输的分子机制与经典实验、胞吞与胞内体途径
复习目标： 掌握蛋白质分选信号与共翻译转运机制；理解内质网的质量控制与 UPR；掌握高尔基体的加工分选功能；熟悉囊泡运输的分子基础及胞吞途径的多样性。

一、细胞区室化与无膜细胞器

1. 膜包被区室（Membrane-enclosed Compartments）

真核细胞通过膜系统划分为不同区室，各具特定功能。肝细胞中各主要区室体积占比（参考 Lecture 5）：

细胞质基质 (Cytosol)：54%
线粒体 (Mitochondria)：22%
粗面内质网腔：9%
滑面内质网 + 高尔基体腔：6%
细胞核：6%
过氧化物酶体、溶酶体、内体各占 1%。

2. 无膜区室与液-液相分离 (Phase Separation)

液-液相分离 (Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS)：细胞内的某些蛋白质和 RNA 可通过多价相互作用聚集成液滴状的无膜结构，如 P颗粒（P-granules）、核仁、应激颗粒等。
生物学意义：富集特定分子、加速生化反应、调控信号转导。2023年生命科学突破奖授予了 Clifford P. Brangwynne 和 Anthony A. Hyman，以表彰他们在该领域的贡献。

二、蛋白质分选与跨膜转运机制

1. 蛋白质分选的三大途径

门控运输 (Gated transport)：通过核孔，进出细胞核（需 NLS/NES）。
跨膜运输 (Transmembrane transport)：通过膜上移位子 (Translocon)，进入 ER、线粒体、叶绿体、过氧化物酶体。
囊泡运输 (Vesicular transport)：通过囊泡出芽与融合，在 ER、高尔基体、质膜、内体、溶酶体之间穿梭。

2. 内质网的共翻译转运 (Cotranslational Translocation)

信号假说 (Signal Hypothesis)：由 Günter Blobel 提出（1999诺奖），提出蛋白质的 N 端信号肽引导其进入 ER。
过程：
1. SRP (信号识别颗粒) 结合新生肽链的 ER 信号肽，暂停翻译。
2. SRP 结合 ER 膜上的 SRP 受体。
3. 核糖体与 Sec61 移位子对接，翻译恢复，新生肽链进入 ER 腔。
4. 信号肽酶切除信号肽。
跨膜蛋白的插入：
- 单次跨膜：有可切除信号肽 + 内部停止转移序列（跨膜段）。
- 多次跨膜：内部信号肽引导，跨膜段交替进行“停止-转移”。
- 尾锚定蛋白 (Tail-anchored)：C 端跨膜段在翻译后由 Get3 识别并插入 ER。

三、内质网 (ER) 的结构与功能

粗面内质网 (rER)：附着核糖体，负责分泌蛋白、膜蛋白的合成。
滑面内质网 (sER)：管状网络，负责脂质合成、Ca²⁺ 储存（Ca²⁺-ATPase 泵入）、解毒（细胞色素 P450）、糖原分解（葡萄糖-6-磷酸酶）。
微粒体 (Microsomes)：细胞匀浆后 ER 破碎形成的封闭囊泡，保留了 ER 的功能（如蛋白合成、糖基化），用于体外研究。

1. N-连接糖基化与质量监控 (Quality Control)

N-连接：连接于 Asn 的酰胺氮（序列 Asn-X-Ser/Thr），始于 ER。
O-连接：连接于 Ser/Thr 的羟基，始于高尔基体。
多萜醇 (Dolichol)：脂质载体，在 ER 膜上组装核心寡糖，然后转移给新生肽链。
质量监控 (ER Quality Control)：
- 伴侣蛋白 BiP、Calnexin 识别未折叠/错误折叠的蛋白。
- 葡萄糖转移酶 (Glucosyl-transferase) 监控并添加葡萄糖。
- PDI (蛋白二硫键异构酶)：在 ER 的氧化环境中促进二硫键的形成和重排。
- 只有正确折叠的蛋白才能离开 ER；错误折叠的蛋白通过 Retrotranslocon 逆向转运到胞质，被泛素化后由蛋白酶体降解（ERAD 途径）。

2. 未折叠蛋白反应 (UPR)

当 ER 中未折叠蛋白过多时，引发 UPR 以增加 ER 伴侣蛋白的合成，恢复稳态：

IRE1（跨膜激酶）：自磷酸化，利用其内切核酸酶活性剪切 XBP1 mRNA，形成转录因子 XBP1s，入核激活伴侣基因。
PERK：磷酸化 eIF2α，抑制全局翻译，减少新蛋白进入 ER。
ATF6：转入高尔基体被切割，释放转录因子入核。

3. ER 驻留蛋白的回收 (KDEL Receptor)

ER 驻留蛋白具有 C 端 KDEL 序列。
如果逃逸到高尔基体，KDEL 受体在高尔基体较低 pH 下与之结合，通过 COPI 囊泡将它们运回 ER。
在 ER 较高 pH 下，KDEL 受体与蛋白分离。

4. 膜脂的合成与转位

大部分膜脂在 ER 合成，插入脂双层胞质侧。
Scramblase（翻转酶，属于 ABC 转运蛋白家族）：在 ER 膜上无选择性地使脂质双向翻转，导致 ER 膜脂分布对称。
Flippase（翻转酶）：在质膜和高尔基体上，消耗 ATP 将特定脂质（如 PS、PE）单向翻转到胞质侧，维持膜的不对称性。

四、高尔基体 (Golgi Apparatus) 的结构与功能

结构：由顺面 (cis)、中间面 (medial)、反面 (trans) 及反面高尔基体网络 (TGN) 组成。顺面靠近 ER，反面靠近质膜。
区域差异（细胞化学反应）：
- cis 面：嗜锇反应。
- medial 面：NADP 酶（烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸酶）标志。
- trans 面：TPP 酶（焦磷酸硫胺素酶）、CMP 酶。

1. 蛋白质的加工修饰

N-连接糖基化的修剪：切除甘露糖，添加 GlcNAc、半乳糖、唾液酸 (NANA) 等。
O-连接糖基化：在 Ser/Thr 上加 GalNAc。
蛋白水解加工 (Proteolysis)：如胰岛素的成熟。在调节型分泌途径中，胰岛素原 (Proinsulin) 在分泌颗粒中被 PC2、PC3 等内切蛋白酶切割，产生有活性的胰岛素和 C肽。
其他修饰：棕榈酰化（脂质修饰）、酪氨酸硫酸化等。

2. 高尔基体的成熟模型（两个假说）

囊泡运输模型 (Vesicular Transport Model)：高尔基体膜囊是稳定的，货物通过囊泡在囊泡间顺向穿梭。
囊膜成熟模型 (Cisternal Maturation Model)：被广泛接受。新的膜囊在顺面形成，整个膜囊逐渐向反面移动并成熟，同时顺向携带货物，逆向囊泡（COPI）将加工酶运回前一个膜囊。

3. 分泌途径 (Secretory Pathways)

组成型分泌 (Constitutive Secretion)：无调节，持续不断将新合成的膜蛋白、脂质和分泌蛋白运送到质膜（如成纤维细胞分泌胶原）。
调节型分泌 (Regulated Secretion)：专特化细胞（如内分泌、外分泌、神经元），分泌产物储存在分泌颗粒 (Secretory granules) 中，只有当细胞收到特定信号（如激素、神经递质、Ca²⁺ 内流）时才发生胞吐（如胰岛 β 细胞释放胰岛素）。
分泌颗粒的浓缩机制：强电荷相互作用、分子间二硫键、强离子相互作用。

五、囊泡运输 (Vesicular Transport) 的机制与经典实验

1. 2013年诺贝尔生理学或医学奖

表彰 James E. Rothman, Randy W. Schekman 和 Thomas C. Südhof 在发现囊泡运输调节机制中的贡献。

Randy Schekman：利用酵母温度敏感突变体（sec 突变体）发现分泌途径被阻断（细胞内积累囊泡），鉴定出一系列 sec 基因。
James Rothman：利用无细胞体系 (Cell-free system) 重现高尔基体间的囊泡运输，发现了 SNARE 蛋白及融合机制。
Thomas Südhof：发现了神经元中响应钙离子触发囊泡融合的传感器蛋白（如 Synaptotagmin）。

2. 囊泡出芽与包被蛋白 (Coat Proteins)

COPII：介导 ER → 高尔基体的顺向运输。起始 G 蛋白为 Sar1。
COPI：介导高尔基体内部逆向运输（如回收 KDEL 受体、回收加工酶）以及高尔基体 → ER 的逆向运输。起始 G 蛋白为 ARF。
Clathrin（网格蛋白）：介导 TGN → 内体/溶酶体，以及质膜的内吞。呈三曲臂状 (triskelion)。切离需要 Dynamin（发动蛋白，GTP酶）。

3. 囊泡的锚定与融合

Rab 蛋白：GTP 酶，提供靶向特异性，促进囊泡与靶膜的锚定 (tethering)。
SNARE 复合体：v-SNARE（囊泡上）与 t-SNARE（靶膜上）拉链式配对，拉近两层膜促发融合。融合后由 NSF（含 ATPase 活性）和 α-SNAP 解开 SNARE 复合体循环利用。

六、胞吞作用 (Endocytosis) 与胞内体途径

1. 胞吞的类型

吞噬作用 (Phagocytosis)：摄取大颗粒（>1 μm，如细菌、细胞碎片），依赖肌动蛋白聚合形成伪足，仅限于专职吞噬细胞（巨噬细胞、中性粒细胞）。
胞饮作用 (Pinocytosis)：摄取液体和溶质。
- 巨胞饮 (Macropinocytosis)：非特异性，形成大的巨胞饮体 (Macropinosome)。
- 网格蛋白介导的胞吞 (Clathrin-mediated endocytosis)：受体介导，形成 ~120 nm 的包被小窝。
- 胞膜窖介导的胞吞 (Caveolin-mediated endocytosis)：形成 ~80 nm 的窖 (Caveolae)，参与跨内皮细胞运输 (Transcytosis) 和信号传导。
- 非网格蛋白/窖不依赖途径 (CLIC/GEEC)、Flotillin 依赖途径等。

2. 受体介导的胞吞 (Receptor-Mediated Endocytosis, RME)

经典模型：LDL（低密度脂蛋白）摄取与胆固醇代谢。
- LDL 结合细胞膜上的 LDL 受体 → 受体聚集在网格蛋白包被小窝 (Coated pit) → Dynamin 切断形成包被囊泡 → 脱被 → 与早期内体融合。
- 内体低 pH (pH~5.0) 导致 LDL 与受体分离 → 受体通过回收内体回到质膜，LDL 运往溶酶体降解释放游离胆固醇。
- 家族性高胆固醇血症 (Familial Hypercholesterolemia)：LDL 受体突变导致无法摄取 LDL，血液胆固醇升高，引发动脉粥样硬化。（Brown & Goldstein 1985诺奖）
转铁蛋白循环 (Transferrin cycle)：铁结合转铁蛋白在质膜中性 pH 下结合受体被内吞；在早期内体低 pH 下释放铁离子；脱铁转铁蛋白 (Apotransferrin) 与受体复合物回到质膜，中性 pH 下释放。

3. 胞内体 (Endosomes) 的分选与命运

早期内体 (Early Endosome)：管状网络，负责分选。
内吞受体的三种命运：
1. 回收 (Recycling)：回到质膜（如 LDL 受体、转铁蛋白受体）。部分蛋白储存在回收内体中（如 Glut4 储存囊泡，受胰岛素刺激后移位到质膜）。
2. 降解 (Degradation)：进入晚期内体 (Late Endosome / Multivesicular Body, MVB)，最终与溶酶体融合被水解。
3. 转胞吞作用 (Transcytosis)：跨过上皮细胞。如新生儿肠道上皮细胞通过 Fc 受体将母体 IgG 从肠腔转运到血液。

4. 多囊泡体 (MVB) 与外泌体 (Exosome)

MVB 的形成：早期内体膜向内出芽，形成包含小囊泡的腔室。涉及 ESCRT 复合体（识别泛素化受体，如 EGFR）。
外泌体：当 MVB 与质膜融合时，内部的小囊泡被释放到细胞外，称为外泌体，是细胞间通讯的重要载体。

5. 上皮细胞的极性维持 (Polarity)

直接分选：TGN 直接产生不同的囊泡，分别运往顶端膜 (Apical) 和基底外侧膜 (Basolateral)。
间接分选：TGN 产生的囊泡先运往基底外侧膜，然后通过内吞和转胞吞作用运往顶端膜。

复习自测提示

1. ER 的共翻译转运与翻译后转运的区别？信号肽、SRP、Sec61 的功能。

区别：共翻译转运是指蛋白质在核糖体上边合成边进入内质网腔（主要途径）；翻译后转运是指蛋白质在胞质中完全合成后，再通过分子伴侣（如 Hsp70）解折叠并运送入细胞器（如线粒体、叶绿体或 ER 的尾锚定蛋白）。
信号肽：多肽链 N 端的 15-30 个氨基酸序列，引导核糖体到 ER 膜上，进入 ER 后被信号肽酶切除。
SRP（信号识别颗粒）：结合信号肽，暂停翻译，并将核糖体引导至 ER 膜上的 SRP 受体。
Sec61：ER 膜上的移位子（Translocon）通道，新生肽链通过它进入 ER 腔或侧向插入脂双层。

2. 内质网的质量监控 (QC) 和 UPR 的机制。KDEL 回收的机制。

QC 机制：伴侣蛋白（如 BiP、Calnexin）和 PDI 帮助蛋白质折叠；若最终折叠错误，通过 Retrotranslocon 逆向转运至胞质，经泛素化后被蛋白酶体降解（ERAD）。
UPR 机制：ER 中未折叠蛋白过多时，激活三条感应通路：IRE1（剪接 XBP1 mRNA 入核）、PERK（磷酸化 eIF2α 抑制全局翻译）、ATF6（入高尔基体切割后入核），以增加 ER 伴侣蛋白表达，恢复稳态。
KDEL 回收：ER 驻留蛋白 C 端带有 KDEL 序列。逃逸至高尔基体后，在较低 pH 下与 KDEL 受体结合，通过 COPI 囊泡运回 ER；在 ER 较高 pH 下释放。

3. 高尔基体的膜囊成熟模型和囊泡运输模型的异同。

囊泡运输模型：高尔基体的膜囊是稳定静止的，货物靠囊泡在膜囊间顺向穿梭运输。
膜囊成熟模型（主流）：高尔基体膜囊本身在移动并逐渐成熟。新的膜囊在 cis 面形成，逐渐向 trans 面移动，同时顺向携带货物，逆向囊泡（COPI）将加工酶运回前一层膜囊。
相同点：都承认存在物质的定向运输和加工酶的分布差异。不同点：膜囊本身是否在移动和演变。

4. 调节型分泌和组成型分泌的区别；胰岛素原的加工过程。

组成型分泌：所有细胞均有，无调节、持续不断地将新合成的蛋白质和脂质运送至质膜。
调节型分泌：特化细胞（如内分泌细胞），蛋白质储存在分泌颗粒中，只有在收到特定信号（如 Ca²⁺ 内流）时才发生胞吐。
胰岛素原加工：在 TGN 处被分选进入未成熟的分泌颗粒。在颗粒成熟过程中，胰岛素原被 PC2、PC3 等内切蛋白酶切割，产生有活性的胰岛素和 C 肽，并在酸性环境和锌离子参与下形成致密核心沉淀。

5. 囊泡出芽的三种包被蛋白 (COPII, COPI, Clathrin) 的功能及它们的作用位置。

COPII：介导 ER → 高尔基体的顺向运输。起始蛋白为 Sar1。
COPI：介导高尔基体内部（反→顺）及高尔基体 → ER 的逆向运输（如回收 KDEL 受体和加工酶）。起始蛋白为 ARF。
Clathrin（网格蛋白）：介导 TGN → 内体/溶酶体，以及质膜的内吞。囊泡颈部的切离需要 Dynamin（发动蛋白）。

6. Schekman 和 Rothman 的经典实验分别证明了什么？

Schekman：利用酵母温度敏感突变体（sec 突变体），证明分泌途径是由一系列特定基因（sec 基因）调控的，突变会导致囊泡在细胞内积累。
Rothman：利用体外无细胞体系（Cell-free system）重现高尔基体间的囊泡运输，证明了囊泡融合需要特定的膜蛋白，发现了 SNARE 复合体及融合机制。

7. 受体介导的胞吞（如 LDL 和转铁蛋白）过程，及受体在内体中的分选命运。

LDL 过程：LDL 结合受体后在网格蛋白小窝内吞；早期内体低 pH 导致 LDL 与受体分离；受体回收至质膜，LDL 送入溶酶体释放游离胆固醇。
转铁蛋白过程：铁结合转铁蛋白在中性 pH 下结合受体内吞；内体低 pH 下释放铁离子；脱铁转铁蛋白-受体复合物回收至质膜，在中性 pH 下释放。
受体命运：① 回收（Recycling，如 LDL 受体）；② 降解（Degradation，进入 MVB/溶酶体）；③ 转胞吞（Transcytosis）。

8. 什么是转胞吞作用 (Transcytosis)？举例说明。

定义：大分子或颗粒通过受体介导的内吞进入细胞一侧，穿越细胞质后，从质膜的另一侧通过胞吐释放出去的过程。
例子：新生儿肠道上皮细胞通过表面的 Fc 受体，将母乳中的母体 IgG 从肠腔摄取，跨越上皮细胞转运到血液中，为新生儿提供被动免疫。

9. 多囊泡体 (MVB) 和 ESCRT 复合体的功能，以及外泌体的来源。

MVB：晚期内体，形态上包含许多内部小囊泡，负责将泛素化的膜蛋白和脂质分选进入内部小囊泡，最终送往溶酶体降解。
ESCRT 复合体：负责识别带有泛素标签的货物受体，并驱动内体膜向内出芽，形成 MVB 的内部小囊泡。
外泌体来源：当 MVB 与质膜融合时，它内部的小囊泡被释放到细胞外，这些释放出的小囊泡即为外泌体，可用于细胞间通讯。

什么是转胞吞作用 (Transcytosis)？举例说明。
多囊泡体 (MVB) 和 ESCRT 复合体的功能，以及外泌体的来源。

细胞生物学学习笔记 5 | 物质的跨膜运输：从被动扩散到主动泵

Wed, 21 Oct 2026 00:00:00 +0000

细胞生物学学习笔记 5 | 物质的跨膜运输：从被动扩散到主动泵

对应课件： Lecture 4 - Transport-sorting 2026（Page 4–46，Chapter 5 部分）
本章核心内容： 膜运输原理、被动运输、通道与载体蛋白、主动运输（四类 ATP 泵）、间接主动运输（协同转运）
复习目标： 掌握被动与主动运输的区别；区分载体与通道蛋白；理解 Na⁺/K⁺ 泵机制；熟悉协同转运。

一、膜运输原理与被动运输

通透性：脂双层对离子高度不通透；疏水小分子（O₂, CO₂）和小的不带电极性分子（H₂O, 尿素）可简单扩散。
两类运输蛋白：
- 通道蛋白 (Channel)：仅被动运输，形成亲水孔道，速率快，不饱和，有门控（电压/配体/机械力如 Piezo）。
- 载体蛋白 (Carrier)：主动和被动皆可，结合溶质发生构象改变，速率慢，可饱和（米氏动力学）。分为 uniport（单向）, symport（同向）, antiport（反向）。

二、主动运输 (Active Transport)

逆电化学梯度，需能量。三大能量来源：ATP 水解、光能、离子梯度。

1. 四类 ATP 驱动泵

P-class：转运中会被磷酸化。如：Na⁺/K⁺ 泵、Ca²⁺ 泵、胃 H⁺/K⁺ 泵。
F-class：利用 H⁺ 梯度合成 ATP。如：线粒体内膜、类囊体膜。
V-class：水解 ATP 泵 H⁺，不形成磷酸化中间体。酸化溶酶体、液泡。
ABC-class：最大转运蛋白家族。底物广泛，如 MDR1 多药耐药蛋白。

2. Na⁺/K⁺ 泵 (P-type)

机制：3 Na⁺ 出，2 K⁺ 进。磷酸化时向外开放（亲和 K⁺），去磷酸化时向内开放（亲和 Na⁺）。
意义：消耗细胞 1/3 ATP；维持电化学梯度（兴奋性）；维持渗透压稳定体积（动物细胞泵出离子，植物靠细胞壁，原生动物靠伸缩泡）。
抑制剂：哇巴因（Ouabain）、地高辛（Digoxin，强心剂）。

三、间接主动运输（协同转运）

利用主动泵建立的离子梯度（动物为 Na⁺，植物/细菌为 H⁺）驱动其他物质逆梯度运输。

小肠吸收葡萄糖：顶端膜 Na⁺-葡萄糖同向转运体，利用 Na⁺ 顺梯度进入细胞，驱动葡萄糖逆 20000 倍梯度进入细胞。基底膜由 Na⁺/K⁺ 泵维持 Na⁺ 梯度。
强心剂原理：抑制 Na⁺/K⁺ 泵 → 胞内 Na⁺ 升高 → Na⁺/Ca²⁺ 反向转运减弱 → 胞内 Ca²⁺ 升高 → 心肌收缩力增强。

细胞生物学学习笔记 4 | 细胞外基质与细胞连接：从 ECM 到细胞间通讯

Mon, 19 Oct 2026 07:00:00 +0000

细胞生物学学习笔记 4 | 细胞外基质与细胞连接：从 ECM 到细胞间通讯

对应课件： Lecture 3 - Memb-Junc 2026，Page 55–92（Chapter 4 主体）；Lecture 4 - Transport-sorting 2026，Page 1–2（衔接复习内容）
本章核心内容： 细胞外基质（ECM）的成分与功能、细胞连接的类型与作用、细胞-基质黏附（整合素）、植物细胞壁
复习目标： 熟悉 ECM 的主要成分及其结构功能关系；能比较四种动物细胞连接的结构与功能；理解整合素在细胞-基质黏附中的作用；了解植物细胞壁的组成与层次。

一、细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）

1. ECM 总览

ECM 是由细胞分泌到胞外的蛋白质和多糖组装而成的有序网络，与产生它的细胞表面紧密关联。ECM 不仅提供物理支撑，还参与细胞信号转导、迁移、增殖和分化。

成分类型	代表分子	主要功能
糖胺聚糖（GAGs）	透明质酸（hyaluronan）	吸水形成凝胶，抗压缩
蛋白聚糖（Proteoglycans）	aggrecan、perlecan、decorin	核心蛋白 + GAG 链，形成“鸡毛掸子”状，赋予组织抗压性
纤维状蛋白	胶原蛋白（collagen）、弹性蛋白（elastin）、纤连蛋白（fibronectin）	抗张强度、弹性、细胞黏附
基膜蛋白	层粘连蛋白（laminin）、IV 型胶原、nidogen	基膜的主要成分，支撑上皮

2. 糖胺聚糖（GAGs）与透明质酸

结构：重复二糖单位（A-B-A-B），通常带负电（硫酸化或羧基化）。
透明质酸（hyaluronan）：最简单的 GAG，由多达 25,000 个非硫酸化二糖单位重复构成，不共价连接核心蛋白。
功能：带负电的 GAGs 吸引阳离子和水，形成多孔水合凝胶（porous hydrated gel），抵抗压缩力（如关节滑液、眼玻璃体）。

3. 蛋白聚糖（Proteoglycans）

结构：核心蛋白（core protein）共价连接多条 GAG 链（如硫酸软骨素、硫酸角质素）。
聚集形式：多个蛋白聚糖通过连接蛋白（link protein）非共价连接到透明质酸长链上，形成巨大的聚集蛋白聚糖（aggrecan aggregate），呈“鸡毛掸子”状。
分布：角膜、骨、软骨。
功能：赋予组织凝胶样特性和抗压能力。

4. 胶原蛋白（Collagen）

分布：动物体内最丰富的蛋白质，仅存在于 ECM。
结构：三条多肽链（α 链）形成左手螺旋，再缠绕成右手三股超螺旋（triple helix）；重复序列为 Gly-X-Y（X 常为脯氨酸，Y 常为羟脯氨酸）。
纤维状胶原：多数胶原为纤维状（fibrillar），提供高抗张强度。
合成过程：
1. 在 ER 中合成前 α 链（prepro-α chain）；
2. 脯氨酸和赖氨酸羟化（需要维生素 C）；
3. 糖基化；
4. 三条前 α 链自组装成三股螺旋（procollagen）；
5. 分泌到胞外，切去前肽（propeptide）；
6. 自组装成原纤维（fibril），并通过赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase）催化交联，增强强度。
疾病：胶原蛋白异常可导致成骨不全（osteogenesis imperfecta）、埃勒斯-当洛斯综合征（Ehlers-Danlos syndrome）；维生素 C 缺乏导致坏血病（scurvy），因羟化不足影响胶原稳定性。

5. 弹性蛋白（Elastin）

形成可拉伸的网络，赋予组织弹性（如皮肤、肺、血管壁）。
拉伸时伸展，放松时恢复卷曲；通过交联（cross-link）形成网络。

6. 纤连蛋白（Fibronectin）

结构：二聚体糖蛋白，呈 V 形，含多个结构域：胶原结合域、肝素结合域、细胞结合域、自 association 域。
关键序列：RGD（Arg-Gly-Asp），是整合素（integrin）识别的细胞结合序列。
功能：介导细胞与 ECM 的黏附；细胞迁移、伤口愈合、胚胎发育。
应用：含 RGD 的化学物可竞争性抑制整合素功能。

7. 基膜（Basal Lamina）

位置：上皮细胞下方，厚约 50 nm，分隔上皮与结缔组织。
主要成分：
- IV 型胶原蛋白（type IV collagen）；
- 层粘连蛋白（laminin）：十字形糖蛋白，含 α、β、γ 三条链；
- 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（perlecan）；
- nidogen（连接层粘连蛋白和 IV 型胶原）。
细胞受体：主要是整合素（integrins），也可与 dystroglycan 结合。
功能：支撑上皮、过滤、组织分隔、指导细胞分化。

二、细胞连接（Cell Junctions）

动物细胞间主要有四种连接类型，植物细胞有胞间连丝。

类型	功能	跨膜蛋白	胞内连接	细胞骨架
紧密连接（Tight junction）	封闭细胞间隙，形成不透性屏障；阻止膜蛋白侧向扩散	Claudin、Occludin	ZO 蛋白	肌动蛋白（actin）
桥粒（Desmosome）	机械连接，抗张强度	非经典钙粘蛋白（desmoglein、desmocollin）	桥粒斑蛋白（desmoplakin）、斑菲素（plakophilin）	中间丝（intermediate filaments）
黏着带（Adherens junction）	机械连接，响应力并重塑肌动蛋白	经典钙粘蛋白（E-cadherin）	α-、β-、γ-catenin	肌动蛋白（actin）
间隙连接（Gap junction）	直接电化学通讯，交换小分子	连接子（connexon，由 6 个 connexin 组成）	无	无

1. 紧密连接（Tight Junctions）

位置：上皮细胞顶端（apical）侧面，形成“封闭带”。
结构：跨膜蛋白 claudin 和 occludin 形成封闭链（sealing strands）；胞内与 ZO 蛋白结合，连接肌动蛋白。
功能：
- 封闭细胞间隙，阻止大分子通过（如血脑屏障、肠上皮屏障）；
- 阻止膜蛋白在顶端和基底面之间侧向扩散，维持细胞极性。
实验证据：示踪分子（tracer molecule）无法通过紧密连接；冷冻蚀刻显示封闭链网络。

2. 桥粒（Desmosomes）与半桥粒（Hemidesmosomes）

桥粒

结构：相邻细胞间的盘状连接（disc-shaped）；跨膜蛋白为非经典钙粘蛋白（desmoglein、desmocollin）；胞内通过桥粒斑蛋白（desmoplakin）、斑菲素（plakophilin）连接中间丝（IFs）。
功能：提供机械强度，抗压力和张力（如皮肤、心肌）。
自身免疫病：天疱疮（pemphigus）由抗 desmoglein 抗体引起，导致表皮细胞间连接破坏。

半桥粒

位置：细胞与基膜的连接（如上皮细胞基底面）。
跨膜蛋白：整合素（integrin α6β4）。
胞内连接：中间丝（角蛋白）。
胞外配体：层粘连蛋白（laminin）。
疾病：大疱性表皮松解症（epidermolysis bullosa）可由整合素或层粘连蛋白突变引起。

3. 黏着带（Adherens Junctions）与黏着斑（Focal Contacts）

黏着带

位置：上皮细胞中环绕细胞的黏合带（zonula adherens），位于紧密连接下方。
跨膜蛋白：经典钙粘蛋白（E-cadherin）。
胞内连接：catenin（α、β、γ）连接肌动蛋白（actin）。
钙粘蛋白特性：同种亚型之间相互结合（homophilic），依赖 Ca²⁺；调控发育中的细胞分选（如神经管形成、神经嵴迁移）。

黏着斑

位置：细胞与 ECM 的局部接触（in vitro 培养细胞中常见）。
跨膜蛋白：整合素（integrin）。
胞内连接：talin、vinculin、α-actinin 等连接肌动蛋白。
功能：细胞迁移、力感知、信号转导。

4. 选择素（Selectins）

功能：介导白细胞与血管内皮细胞的瞬时黏附（滚动，rolling）。
特点：钙依赖；亲和力较低，结合和解离快。
类型：P-selectin、E-selectin、L-selectin。
生理意义：炎症反应中白细胞从血管滚动、黏附并进入组织。

5. 间隙连接（Gap Junctions）

结构：两个细胞各提供一个连接子（connexon），每个连接子由 6 个连接蛋白（connexin） 亚基构成；两个连接子对接形成通道。
孔径：约 1.4 nm；允许小于 1000 Da 的分子通过（离子、小分子代谢物、第二信使）。
功能：
- 电突触（electrical synapse），使动作电位快速传播；
- 心肌、平滑肌、肝细胞的代谢偶联；
- 胚胎发育中的细胞间通讯；
- 肿瘤细胞中 GJIC（gap junction intercellular communication）常减弱或缺失。
连接子类型：同型（homotypic）、异型（heterotypic）、同聚（homomeric）、异聚（heteromeric）。

6. 胞间连丝（Plasmodesmata）

位置：植物细胞特有的连接，穿过细胞壁，连接相邻细胞的细胞质。
结构：内质网形成**链样管（desmotubule）**穿过；周围有胞质环（annulus）。
功能：允许小分子和部分大分子通过，参与物质运输和信号传递。

三、细胞-基质黏附（Cell-Matrix Adhesion）

1. 整合素（Integrins）

结构：跨膜异二聚体（α 亚基 + β 亚基）。
配体：胞外域结合 ECM 配体（如纤连蛋白的 RGD 序列、层粘连蛋白、胶原）；胞内域结合细胞骨架（talin、vinculin、α-actinin、actin）。
激活：整合素可处于低亲和力或高亲和力构象；胞内信号（inside-out signaling）可激活整合素。
功能：
- 黏附细胞到基质；
- 感知和传递环境信号到细胞内（outside-in signaling）；
- 调控细胞迁移、增殖、存活。
RGD 序列：Arg-Gly-Asp，是纤连蛋白等 ECM 蛋白中与整合素结合的关键序列。含 RGD 的化学物可抑制整合素功能。

2. 黏着斑与半桥粒

黏着斑（focal contacts）：体外培养细胞与基质的局部接触，连接肌动蛋白。
半桥粒（hemidesmosomes）：体内上皮细胞与基膜的紧密连接，连接中间丝。

四、细胞壁（Plant Cell Walls）

1. 组成

成分	特点与功能
纤维素（cellulose）	微纤丝（microfibrils）提供抗张强度；由质膜上的玫瑰花结（rosettes）复合体合成
半纤维素（hemicellulose）	连接纤维素微纤丝，形成网络
果胶（pectins）	形成凝胶，黏合细胞；中层（middle lamella）富含果胶
结构蛋白	富含羟脯氨酸、脯氨酸、甘氨酸的蛋白

2. 层次

初生壁（primary cell wall）：柔性，允许细胞生长；纤维素微纤丝排列较松散。
次生壁（secondary cell wall）：厚而坚硬，多层结构；纤维素微纤丝排列致密平行。
中层（middle lamella）：富果胶，黏合相邻细胞。

3. 功能

提供保护，抵抗机械磨损（abrasion）、渗透胁迫（osmotic stress）和病原体（pathogens）；
维持细胞形状，抵抗膨压。

五、本章关键点总结

主题	核心要点
ECM 成分	GAGs（透明质酸）、蛋白聚糖、胶原蛋白（三股螺旋，Gly-X-Y）、弹性蛋白、纤连蛋白（RGD）、层粘连蛋白
基膜	IV 型胶原、层粘连蛋白、perlecan、nidogen；整合素介导黏附
紧密连接	claudin/occludin；封闭细胞间隙；维持细胞极性
桥粒	非经典钙粘蛋白；连接中间丝；机械强度
黏着带	E-cadherin；连接肌动蛋白；发育中的细胞分选
间隙连接	connexon（6 个 connexin）；<1000 Da 分子通过；电化学通讯
胞间连丝	植物细胞；内质网链样管；物质运输和信号传递
整合素	αβ 异二聚体；RGD 依赖；细胞-基质黏附；outside-in/inside-out signaling
选择素	白细胞滚动；钙依赖；炎症反应
细胞壁	纤维素、半纤维素、果胶；初生壁、次生壁、中层

六、复习自测题

1. ECM 的主要成分有哪些？透明质酸和蛋白聚糖在结构上有何区别？

主要成分：糖胺聚糖（GAGs）、蛋白聚糖、胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白。
区别：
- 透明质酸：最简单的 GAG，不与核心蛋白共价结合，是游离的长链非硫酸化二糖重复序列。
- 蛋白聚糖：由核心蛋白共价连接多条 GAG 链（如硫酸软骨素）构成，呈“鸡毛掸子”状，可进一步非共价结合到透明质酸上。

2. 胶原蛋白的三股螺旋结构是如何形成的？合成过程中有哪些关键步骤？维生素 C 缺乏为什么会导致坏血病？

合成步骤：在 ER 中合成前 α 链 → 脯氨酸和赖氨酸的羟化（需维生素 C） → 糖基化 → 形成三股螺旋（前胶原） → 分泌到胞外切除前肽 → 自组装成原纤维并交联。
坏血病机制：缺乏维生素 C 导致脯氨酸和赖氨酸羟化不足，三股螺旋结构极不稳定，无法形成坚韧的胶原纤维，导致血管脆性增加、牙龈出血等。

3. 纤连蛋白的 RGD 序列有什么作用？含 RGD 的化学物如何抑制整合素功能？

作用：RGD（Arg-Gly-Asp）是纤连蛋白中与细胞表面整合素特异性结合的核心序列。
抑制原理：游离的含 RGD 化学物作为竞争性拮抗剂，抢先结合细胞表面的整合素，从而阻止细胞与 ECM 中的纤连蛋白真实结合。

4. 基膜的主要成分有哪些？整合素在基膜黏附中起什么作用？

成分：IV 型胶原、层粘连蛋白（Laminin）、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（Perlecan）、Nidogen。
作用：整合素作为跨膜受体，胞外结合层粘连蛋白，胞内连接细胞骨架（在半桥粒中连接中间丝），将上皮细胞牢固锚定在基膜上。

5. 比较紧密连接、桥粒、黏着带和间隙连接的结构与功能。

紧密连接：跨膜蛋白（Claudin/Occludin）连接肌动蛋白；封闭细胞间隙，维持细胞极性。
桥粒：跨膜蛋白（非经典钙粘蛋白）连接中间丝；提供极强的抗机械张力。
黏着带：跨膜蛋白（经典钙粘蛋白 E-cadherin）连接肌动蛋白；介导细胞间机械连接及发育中的细胞分选。
间隙连接：由 Connexon 组成；介导相邻细胞的电化学通讯，允许小分子通过。

6. 桥粒和半桥粒在跨膜蛋白、胞内连接和细胞骨架上有何区别？

桥粒（细胞-细胞）：跨膜蛋白为非经典钙粘蛋白（Desmoglein/Desmocollin），胞内通过桥粒斑蛋白连接中间丝。
半桥粒（细胞-基质）：跨膜蛋白为整合素（α6β4），胞外结合层粘连蛋白，胞内通过网蛋白连接中间丝。

7. 间隙连接的连接子由什么组成？哪些物质可以通过间隙连接？

组成：由 6 个连接蛋白（Connexin）亚基构成一个连接子（Connexon），相邻细胞各提供一个对接。
通过物质：离子、第二信使（如 cAMP）、小分子代谢物（分子量 < 1000 Da）。

8. 钙粘蛋白和整合素在细胞黏附中分别起什么作用？它们的配体有何不同？

钙粘蛋白：主要介导细胞-细胞的同种（homophilic）黏附（依赖 Ca²⁺）。配体是相邻细胞上的同种钙粘蛋白。
整合素：主要介导细胞-ECM（或细胞-细胞）的异种黏附。配体是 ECM 蛋白（如纤连蛋白的 RGD 序列、层粘连蛋白等）。

9. 选择素在炎症反应中如何介导白细胞滚动？

内皮细胞被激活表达 P/E-选择素，与白细胞表面的糖基配体结合。由于这种结合亲和力低且解离快，加上血流的冲刷，使白细胞在血管内皮表面发生滚动（Rolling），为后续整合素的强黏附和穿出血管做准备。

10. 植物细胞壁的初生壁和次生壁有何区别？纤维素是如何合成的？

区别：初生壁薄且柔韧，允许细胞生长，微纤丝排列松散；次生壁厚且坚硬，位于初生壁内侧，微纤丝排列致密平行，不支持细胞生长。
合成：由质膜上的玫瑰花结（Rosettes）复合体（纤维素合酶）合成微纤丝。

11. 胞间连丝的结构如何？它允许哪些物质通过？

结构：贯穿植物细胞壁的通道，内部有由内质网延伸形成的链样管（Desmotubule），周围环绕胞质环。
通过物质：离子、小分子，以及部分大分子（如 RNA、蛋白质），是植物细胞通讯和物质运输的桥梁。

12. 什么是 outside-in signaling 和 inside-out signaling？请以整合素为例说明。

Outside-in（外向内）：胞外配体结合整合素后，引起整合素胞内域构象改变，招募信号蛋白或骨架蛋白，将外部信号传递到细胞内。
Inside-out（内向外）：胞内信号（如 talin 结合）作用于整合素胞内域，引起胞外域构象改变，使其从低亲和力状态变为高亲和力状态，从而增强与配体的结合。

参考文献与延伸阅读

Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell, 7th Ed. W. W. Norton & Company, 2022.
Lodish, H., et al. Molecular Cell Biology, 9th Ed. W. H. Freeman, 2021.
丁明孝、王喜忠、张传茂、陈建国主编，《细胞生物学》（第五版），高等教育出版社，2020.
Hynes, R. O. (2009). The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science, 326(5957), 1216–1219.
Goodenough, D. A., & Paul, D. L. (2009). Gap junctions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 1(1), a002576.

笔记说明： 常考的重点包括：ECM 主要成分（尤其是胶原蛋白和纤连蛋白 RGD）、四种细胞连接的结构与功能对比、整合素与 RGD、间隙连接的通透性、植物细胞壁的层次。复习时建议结合课件中的示意图记忆结构关系，尤其是桥粒、黏着带和间隙连接的分子组成。

细胞生物学学习笔记 3 | 生物膜：结构模型、化学组成与膜特性

Mon, 19 Oct 2026 00:00:00 +0000

细胞生物学学习笔记 3 | 生物膜：结构模型、化学组成与膜特性

对应课件： Lecture 3 - Memb-Junc 2026，Page 1–54（Chapter 3 部分）
本章核心内容： 生物膜结构模型、膜的化学组成（膜脂、膜蛋白、膜糖）、生物膜的三大特征（流动性、不对称性、不均一性）、膜功能概述
复习目标： 掌握流动镶嵌模型与脂筏模型的核心观点；能区分三类膜蛋白与去垢剂的作用；理解膜不对称性与脂筏的生理意义；熟悉膜的主要功能。

一、生物膜结构模型的历史演变

1. 三大经典模型

模型	提出者/时间	核心观点	局限性
单位膜模型（Unit membrane model）	J.D. Robertson（1959）	电镜下质膜呈“暗-亮-暗”三层（trilaminar），所有膜结构相似	无法解释膜的动态变化和蛋白分布差异
流动镶嵌模型（Fluid-mosaic model）	S.J. Singer & G. Nicolson（1972）	脂双层是流动的，膜蛋白像“马赛克”一样镶嵌其中	将膜视为均匀“流体”，忽略了微区结构
脂筏模型（Lipid rafts model）	K. Simons et al.（1997）	质膜上存在富含胆固醇、鞘磷脂和 GPI 锚定蛋白的微结构域	脂筏尺寸小（~70 nm）、动态变化，难以直接观察

考试重点： 流动镶嵌模型是膜生物学的“中心法则（central dogma）”，其核心是脂双层具有流动性，膜蛋白以不同深度嵌入或穿透脂双层。

2. 脂筏（Lipid Rafts）与胞膜窖（Caveolae）

脂筏：质膜和高尔基体反面膜囊（TGN）上富含胆固醇（cholesterol）、**鞘磷脂（sphingolipids）**和 GPI 锚定蛋白的微结构域（microdomains），直径约 70 nm。
功能：作为信号转导的平台（signaling centers），富集特定受体和信号分子。
胞膜窖（Caveola）：一种特殊的脂筏，含有小窝蛋白（caveolin），呈烧瓶状内陷，参与内吞和信号转导。

二、生物膜的化学组成

生物膜主要由脂类（Lipids）、**蛋白质（Proteins）和糖类（Carbohydrates）**组成。

1. 膜脂（Membrane Lipids）

膜脂是**两亲性（amphipathic）**分子，具有亲水头部（hydrophilic head）和疏水尾部（hydrophobic tail）。主要分为三类：

类型	代表分子	特点与功能
磷脂（Phospholipids）	磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）、鞘磷脂（SM）	构成脂双层骨架；PI 可被磷酸化参与信号转导
糖脂（Glycolipids）	神经节苷脂（GM1 ganglioside，含唾液酸 NANA）、半乳糖脑苷脂	位于质膜外侧，参与细胞识别
固醇（Sterols）	胆固醇（cholesterol，仅存在于动物细胞）	调节膜的流动性（低温防冻结，高温防过流动）；降低膜的亲水性

脂质体（Liposome）

磷脂在水溶液中自发形成封闭的囊泡（liposome），内部包裹水相。
应用：药物递送、膜蛋白重构（如纳米磷脂盘 nanodisc）。

磷脂酰肌醇（PI）与信号转导

PI 可被 PI3K 磷酸化为 PIP3，招募下游蛋白（如 AKT）；
PI 可被 磷脂酶 C（PLC） 水解为 DAG 和 IP3，产生第二信使。

磷脂酶分类（易考）：

磷脂酶 A1：切 sn-1 酰基链；

磷脂酶 A2：切 sn-2 酰基链，释放花生四烯酸；

磷脂酶 B：同时具有 A1 和 A2 活性；

磷脂酶 C：切磷酸基团之前，释放 DAG 和磷酸化头部；

磷脂酶 D：切磷酸基团之后，释放磷脂酸和醇。

2. 膜蛋白（Membrane Proteins）

膜蛋白约占生物膜总质量的 20–30%。根据与脂双层的结合方式，分为三类：

类型	结合方式	举例	分离方法
内在膜蛋白（Integral / Intrinsic）	跨膜区（疏水 α 螺旋或 β 桶）嵌入脂双层	通道蛋白、受体、GPI 锚定蛋白	必须用去垢剂（detergent）破坏脂双层
外周膜蛋白（Peripheral / Extrinsic）	通过离子键等弱键结合在膜表面或内在蛋白上	多种磷脂酶、细胞骨架蛋白	改变离子强度（如高盐）即可分离
脂锚定蛋白（Lipid-anchored）	通过共价连接的脂质锚定在膜上	Src 激酶（豆蔻酰化）、Ras（法尼基化）、GPI 锚定蛋白	可用去垢剂或磷脂酶 C 处理

膜蛋白与脂双层结合的几种方式（课件 Page 21）

单次跨膜 α 螺旋；
多次跨膜 α 螺旋；
跨膜 β 桶（β barrel）；
通过两亲性 α 螺旋结合；
通过共价脂质锚定（脂肪酸：豆蔻酰化、棕榈酰化；异戊二烯：法尼基化）；
通过 GPI 锚定（糖脂锚定蛋白）；
与非共价结合的其他膜蛋白结合。

去垢剂（Detergents）

作用：破坏脂双层，溶解膜蛋白，形成蛋白-去垢剂胶束（micelle）。
常用类型：
- SDS：离子型，强变性，常用于 SDS-PAGE；
- Triton X-100：非离子型，温和，常用于膜蛋白提取；
- β-辛基葡萄糖苷（β-octylglucoside）：非离子型，温和，适合重构膜蛋白。
CMC（临界胶束浓度）：去垢剂形成胶束的最低浓度。
纳米磷脂盘（nanodisc）：用膜支架蛋白将磷脂双分子层包裹成盘状，用于重构膜蛋白。

膜蛋白的糖基化

膜蛋白多在**非胞质侧（non-cytosolic side）**被糖基化；
类型：N-连接糖基化（Asn 残基）和 O-连接糖基化（Ser/Thr 残基）；
功能：帮助折叠、增强稳定性、参与细胞识别。

3. 膜糖类与糖被（Glycocalyx）

质膜外侧的糖类通过共价键连接在膜脂（糖脂）和膜蛋白（糖蛋白）上，形成糖被（glycocalyx）。
功能：细胞识别、免疫应答、细胞黏附、保护细胞表面。
糖脂例子：GM1 神经节苷脂，含唾液酸（NANA），位于质膜外侧。

三、生物膜的三大特征

1. 流动性（Fluidity）

膜脂的运动方式

运动方式	说明
侧向扩散（lateral diffusion）	在同一层内移动，最常见
旋转（rotation）	绕自身轴旋转
摆动（flexion）	碳氢链的摆动
翻转（flip-flop）	从一层翻到另一层，很少发生（能量上不利），由 flippase/scramblase 催化

影响流动性的因素

脂肪酸链长度：链越短，流动性越高；
不饱和度：双键越多，流动性越高（顺式双键产生“折角”）；
胆固醇：双向调节（低温增加流动性，高温降低流动性）；
温度：温度升高，流动性增加。

检测流动性的技术

FRAP（荧光漂白恢复，Fluorescence Recovery After Photobleaching）：用激光漂白特定区域，观察荧光恢复速度，判断膜蛋白或膜脂的扩散速率。
FLIP（荧光丢失，Fluorescence Loss In Photobleaching）：反复漂白同一区域，观察整体荧光减弱。
细胞融合实验：小鼠细胞与人细胞融合，荧光标记的膜蛋白在杂交细胞表面重新分布，证明膜蛋白可以侧向扩散。

2. 不对称性（Asymmetry）

膜脂的不对称分布

小叶（leaflet）	主要脂质
外层（exoplasmic / outer）	磷脂酰胆碱（PC）、鞘磷脂（SM）、糖脂
内层（cytosolic / inner）	磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）、胆固醇（部分）

PS 外翻是细胞凋亡（apoptosis）的早期标志，可被巨噬细胞识别。
功能意义：
- 胞质侧蛋白可特异性结合内层脂质头部（如 PKC 结合 PS）；
- PI 可被 PI3K 修饰，招募信号蛋白；
- 磷脂可被磷脂酶切割产生第二信使。

膜蛋白与糖的不对称性

内在膜蛋白定向插入膜中，具有明确的方向性（如 N 端在胞外或胞内）；
膜糖类只分布在质膜外侧（E 面）；
冷冻蚀刻（freeze-fracture）可显示 P 面（protoplasmic face，胞质侧）和 E 面（ectoplasmic face，外质侧）的蛋白颗粒分布差异。

3. 不均一性（Heterogeneity）与脂筏

膜脂在平面上的分布不均匀，形成**脂筏（lipid rafts）**等微结构域。
脂筏富含胆固醇、鞘磷脂和 GPI 锚定蛋白，参与信号转导。
形成因素：鞘磷脂与胆固醇的相互作用、膜骨架限制、紧密连接限制、胞内外蛋白结合。
人工脂双层实验：PC + SM 均匀混合；加入胆固醇后出现侧向相分离（lateral phase separation），形成“筏”样结构。
膜蛋白与脂质的区域化：如豚鼠精子质膜分为前头、后头、尾部三个结构域；上皮细胞顶端膜与基底膜蛋白分布不同，紧密连接阻止膜蛋白侧向扩散。

四、膜功能概述

课件 Page 52–53 概括了生物膜的主要功能：

功能	说明
界定边界	质膜界定细胞边界，膜性细胞器界定细胞内区室
区室化（compartmentalization）	膜形成连续片层，包围细胞内不同区室
物质运输	膜蛋白协助物质在区室间移动
信号转导	膜受体感知外界信号并传递到细胞内
细胞间相互作用	膜介导细胞识别、通讯和连接
生化反应场所	膜提供支架，组织酶促反应
能量转导	膜参与光合作用、氧化磷酸化、离子梯度储能

五、本章关键点总结

主题	核心要点
膜结构模型	单位膜模型 → 流动镶嵌模型（脂双层流动、蛋白镶嵌）→ 脂筏模型（胆固醇+鞘磷脂微区）
膜脂	磷脂、糖脂、胆固醇；两亲性；脂质体；PI 与信号转导；磷脂酶分类
膜蛋白	内在（跨膜，需去垢剂）、外周（弱键，可高盐分离）、脂锚定（GPI、脂肪酸、异戊二烯）
去垢剂	SDS（强变性）、Triton X-100（温和）、β-辛基葡萄糖苷（温和）；CMC；纳米磷脂盘
膜糖	糖蛋白、糖脂、糖被；N-连接/O-连接糖基化；糖类只在外侧
膜特性	流动性（FRAP、FLIP、细胞融合）、不对称性（PS 外翻、糖基外侧）、不均一性（脂筏）
膜功能	界定边界、区室化、运输、信号、细胞间作用、生化反应场所、能量转导

六、复习自测题

流动镶嵌模型的核心观点是什么？脂筏模型补充了什么？

· 流动镶嵌模型：生物膜是由流动的脂双层构成，膜蛋白以镶嵌、贯穿或附着的方式不均匀地分布在脂双层中。 · 脂筏模型补充：指出膜并非均匀的流体，而是存在富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域（脂筏），强调了膜的不均一性。

脂筏的主要成分有哪些？为什么脂筏可以作为信号转导平台？

· 主要成分：胆固醇、鞘磷脂、GPI 锚定蛋白。 · 信号平台原因：脂筏能将特定的受体、信号分子和激酶富集在微小的膜区域内，提高局部浓度，促进信号转导级联反应的高效进行。

膜脂有哪三大类？胆固醇如何调节膜的流动性？

· 三大类：磷脂（甘油磷脂、鞘磷脂）、糖脂、固醇。 · 胆固醇的调节（双向）：在高温下，它限制脂质分子的运动，降低流动性；在低温下，它插入脂质分子间，防止脂质紧密排列，维持流动性。

内在膜蛋白、外周膜蛋白和脂锚定蛋白在分离方法上有何区别？去垢剂的作用原理是什么？

· 分离方法：内在膜蛋白必须用去垢剂破坏脂双层提取；外周膜蛋白用高盐或改变 pH（破坏离子键）即可分离；脂锚定蛋白可用去垢剂或磷脂酶切割。 · 去垢剂原理：两亲性分子，在超过 CMC 时形成胶束，竞争性地取代脂质分子，将膜蛋白从脂双层中溶解出来。

SDS、Triton X-100 和 β-辛基葡萄糖苷各有何特点？CMC 是什么？

· SDS：离子型去垢剂，作用强烈，会使蛋白质完全变性。 · Triton X-100：非离子型去垢剂，温和，常用于提取有活性的膜蛋白。 · β-辛基葡萄糖苷：非离子型，温和，常用于膜蛋白的体外重构。 · CMC：临界胶束浓度（Critical Micelle Concentration），指去垢剂在溶液中开始自发形成胶束的最低浓度。

FRAP 实验如何证明膜的流动性？请描述其基本流程和结果分析。

· 流程：用荧光探针标记细胞表面的膜蛋白或膜脂，用强激光将一小块区域（光斑）的荧光“漂白”（破坏），然后追踪该区域荧光强度的恢复情况。 · 结果分析：如果漂白区荧光迅速恢复，说明周围未被漂白的分子通过侧向扩散移动到了该区域，从而直接证明了膜的流动性。

膜脂的不对称性表现在哪些方面？PS 外翻有什么生理意义？

· 表现：磷脂酰胆碱（PC）和鞘磷脂（SM）主要在外小叶；磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰肌醇（PI）主要在内小叶。 · PS 外翻的意义：正常时 PS 位于内侧；细胞发生凋亡时，PS 会翻转到外侧，成为“吃掉我”（eat-me）信号，被巨噬细胞识别并吞噬。

磷脂酶 A1、A2、B、C、D 分别切割磷脂的哪个部位？

· A1：切 sn-1 位置的酯键（酰基链）。 · A2：切 sn-2 位置的酯键（释放花生四烯酸）。 · B：同时切断 sn-1 和 sn-2 的酰基链（溶血磷脂酶）。 · C：切磷酸二酯键（位于甘油骨架和磷酸之间），释放 DAG 和磷酸化头部。 · D：切磷酸二酯键（位于磷酸和极性头部之间），释放磷脂酸（PA）和醇。

膜蛋白的糖基化发生在哪一侧？N-连接和 O-连接有何区别？

· 位置：发生在非胞质侧（即质膜外侧，或内质网/高尔基体腔内）。 · 区别： · N-连接：连接在 Asn（天冬酰胺）残基上，起始于 ER，核心寡糖为特定结构。 · O-连接：连接在 Ser/Thr（丝氨酸/苏氨酸）的羟基上，主要在高尔基体中进行，通常为 GalNAc。

什么是糖被？它有哪些功能？

· 定义：质膜外表面由膜蛋白（糖蛋白）和膜脂（糖脂）延伸出的寡糖链共同构成的覆盖层。 · 功能：细胞识别、黏附、保护细胞表面免受机械和化学损伤、参与免疫反应和信号转导。

膜蛋白和膜脂如何被限制在特定膜域？紧密连接在其中起什么作用？

· 限制机制：细胞骨架（如肌动蛋白）形成的“栅栏”限制蛋白扩散；脂筏将特定脂质和蛋白组装；以及细胞紧密连接的限制。 · 紧密连接的作用：不仅封闭细胞间隙，还像一道屏障，阻止顶端膜（apical）和基底外侧膜（basolateral）的膜蛋白/膜脂侧向扩散，从而维持上皮细胞的极性。

生物膜的主要功能有哪些？
界定细胞和细胞器的边界，形成独立区室。
提供特定的生化反应场所（如内膜系统）。
物质运输（选择性通透屏障）。
信号转导（受体接收外部信号）。
细胞间相互作用、连接与通讯。
能量转换（如线粒体内膜、叶绿体类囊体膜）。

参考文献与延伸阅读

Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell, 7th Ed. W. W. Norton & Company, 2022.
Lodish, H., et al. Molecular Cell Biology, 9th Ed. W. H. Freeman, 2021.
丁明孝、王喜忠、张传茂、陈建国主编，《细胞生物学》（第五版），高等教育出版社，2020.
Simons, K., & Ikonen, E. (1997). Functional rafts in cell membranes. Nature, 387, 569–572.
Singer, S. J., & Nicolson, G. L. (1972). The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science, 175(4023), 720–731.

笔记说明： 常考的重点包括：流动镶嵌模型、脂筏、膜蛋白类型与去垢剂、FRAP、膜脂不对称性、磷脂酶分类、膜糖分布。复习时建议结合课件中的示意图记忆结构关系。

细胞生物学学习笔记 2 | 细胞生物学研究方法：从显微成像到基因编辑

Sun, 18 Oct 2026 04:00:00 +0000

细胞生物学学习笔记 2 | 细胞生物学研究方法：从显微成像到基因编辑

对应课件： Lecture 2 - Methods 2026
本章核心内容： 荧光显微与电子显微技术、荧光探针与流式细胞术、同位素示踪、细胞组分分离、蛋白质纯化与检测、蛋白质互作研究方法、分子生物学与遗传学方法、模式生物
复习目标： 掌握各类显微技术的原理与适用场景；理解细胞组分分离与蛋白质纯化的基本策略；能区分检测蛋白质互作的不同方法；熟悉基因功能研究的常用手段（敲除、敲低、敲入、CRISPR）。

一、本章总览：研究细胞的方法体系

主线：

研究目的	主要方法
观察细胞	光学显微镜（明场、相差、DIC、暗场、荧光、共聚焦）、电子显微镜（TEM、SEM、冷冻蚀刻、cryo-EM）
标记与追踪	荧光探针（GFP、fura-2、DAPI）、同位素（\(^{32}\text{P}\)、\(^{35}\text{S}\)、\(^{3}\text{H}\)）、脉冲-追踪（pulse-chase）
分离细胞器	细胞组分分离（差速离心、密度梯度离心）
纯化与检测蛋白质	柱层析、SDS-PAGE、等电聚焦、2D 电泳、免疫印迹、质谱
研究蛋白质互作	GST pull-down、FRET、酵母双杂交、噬菌体展示、SPR（Biacore）
研究基因功能	定点突变、RNAi、基因敲除/敲入、LoxP-Cre、CRISPR/Cas9、RNA-seq

考试提示： 每种方法的原理和主要应用是重点，而不是具体操作细节。

二、光学显微镜（Light Microscopy）

1. 分辨率基础

光学显微镜的最大分辨率约为 0.2 μm（200 nm），受可见光波长限制。这决定了它能看到细胞整体、细胞核、染色体等较大结构，但看不到核糖体、膜结构细节。

2. 四种观察活细胞的光学显微技术

技术	原理	特点与适用场景
明场（bright-field）	光直接透射过样品	最简单，对比度低，适合染色后的固定样品
相差（phase-contrast）	将光通过透明样品产生的相位差转换为亮度差	可观察未染色活细胞，能看清细胞内部结构
微分干涉（DIC / Nomarski）	偏振光分成两束相干光，经样品后重新组合产生干涉	细胞有浮雕感，适合观察活细胞动态
暗场（dark-field）	只检测样品侧面散射的光	背景暗、样品亮，适合观察未染色透明样品

记忆点： 相差看“密度差”，DIC 看“厚度差”（浮雕感），暗场看“散射光”。

3. 荧光显微镜（Fluorescence Microscopy）

基本原理

荧光分子吸收特定波长（激发光，excitation）后，发射更长波长（发射光，emission）的光。荧光显微镜通过滤光片系统分离激发光和发射光。

光路关键部件

部件	功能
第一滤光片（excitation filter）	只让特定波长的激发光通过（如 450–490 nm 蓝光）
二向色镜（beam-splitting mirror / dichroic mirror）	反射短波长激发光到样品，透射长波长发射光
第二滤光片（emission filter / barrier filter）	只让特定发射光通过，阻挡残余激发光

常用荧光染料与蛋白

荧光基团	激发/发射（约）	用途
DAPI	358 / 461 nm	染 DNA（细胞核）
GFP	488 / 507 nm	蛋白定位（基因融合标签）
FITC	495 / 519 nm	抗体标记
Cy3	550 / 570 nm	抗体标记
Cy5	650 / 670 nm	抗体标记
Alexa 568	578 / 603 nm	抗体标记

4. 共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）

与常规荧光显微镜的关键区别

普通荧光显微镜会收集来自焦平面以外（上下层）的荧光，导致图像模糊。共聚焦显微镜通过**针孔（pinhole）**只收集焦平面上的光，从而排除焦外光，获得清晰的光学切片（optical section）。

主要应用

Z 轴序列扫描（Z-stack）：逐层扫描，重建细胞或组织的三维结构；
最大强度投影（Maximum Intensity Projection, MIP）：将 Z-stack 中各层最亮点投影到一张图上；
多色成像：同时观察多种蛋白定位；
活细胞成像：观察动态过程。

课件中的例子： 海胆受精卵有丝分裂纺锤体（anti-tubulin 抗体染色），普通荧光下模糊，共聚焦下可清晰看到纺锤体微管纤维。

5. 超分辨率成像技术

技术	原理简述
SIM（structured illumination microscopy）	用结构化照明图案提高分辨率
STORM（stochastic optical reconstruction microscopy）	单分子定位，逐点重建
Deconvolution（去卷积）	通过算法去除光学系统的模糊效应

课件中展示了 ERGIC 与 COPII、LC3 与 IL1B 等蛋白的超分辨率共定位图像，以及中国科学家李栋发展的 GI-SIM（grazing-incidence SIM）用于活细胞中溶酶体、ER、微管的动态成像。

6. 无标记三维光学衍射断层扫描（ODT）

课件中提到陈良怡教授发展的 label-free 3D optical diffraction tomography (ODT)，无需荧光标记即可获得细胞的三维折射率分布图像。

7. 间接免疫细胞化学（Indirect Immunocytochemistry）

原理

一抗（primary antibody）：识别目标抗原（antigen A）；
二抗（secondary antibody）：带有荧光染料、辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）或胶体金等标记，识别一抗。

优点

信号放大：多个二抗可结合一个一抗；
通用性：同一二抗可用于多种一抗；
标记灵活：可换不同标记的二抗实现不同检测目的。

8. 时间延迟显微技术（Time-lapse Microscopy）

在活细胞培养条件下，按固定时间间隔连续拍照，观察细胞运动、分裂、囊泡运输等动态过程。课件中展示了培养成纤维细胞在 0–34 min 内的运动过程。

三、电子显微镜（Electron Microscopy, EM）

1. 为什么需要电子显微镜？

电子束的波长远小于可见光（约 0.004 nm），因此电子显微镜的分辨率远高于光学显微镜，可达 0.1–0.2 nm（原子级）。但电子束在空气中会被散射，因此电镜需要高真空，样品必须固定、脱水、包埋，不能观察活细胞。

2. 透射电镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）

原理

电子束穿过超薄切片（通常 50–100 nm），经电磁透镜聚焦成像。样品中电子密度高的区域（如被锇酸染色的膜）散射电子，在图像上显示为暗区。

样品制备流程

固定（fixation）：常用戊二醛（glutaraldehyde）和四氧化锇（OsO₄）；
脱水：乙醇或丙酮梯度脱水；
包埋（embedding）：环氧树脂（如 Epon、Araldite）；
超薄切片（ultrathin sectioning）：用超薄切片机切 50–100 nm 薄片；
染色：醋酸铀、柠檬酸铅等重金属染色。

应用

观察细胞内部超微结构（细胞器、膜、核糖体、细胞骨架）；
免疫电镜（immuno-EM）：用胶体金标记抗体，定位特定蛋白。

3. 扫描电镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）

原理

电子束扫描样品表面，收集二次电子（secondary electrons）或背散射电子成像。样品表面需喷镀金属（如金、铂）以增加导电性并防止电子积累。

应用

观察细胞表面形貌（微绒毛、纤毛、伪足、细胞间连接）；
立体感强，适合表面结构研究。

4. 冷冻蚀刻（Freeze-Etching / Freeze-Fracture）

原理

样品快速冷冻；
用刀片断裂，断裂面常沿脂双层中间走；
升华表面冰（etching）暴露更多结构；
喷镀铂-碳形成 replica（复型）；
用 TEM 观察复型。

应用

观察膜内蛋白颗粒分布（如质膜 P 面与 E 面）；
观察核孔、紧密连接、间隙连接等膜结构。

5. 冷冻电镜（Cryo-Electron Microscopy, Cryo-EM）

原理

样品在玻璃态冰（vitreous ice）中快速冷冻，不经过固定和染色，保持近生理状态。通过单颗粒重建（single-particle reconstruction）或电子断层扫描（electron tomography）解析结构。

应用

解析蛋白质、病毒、核糖体等大分子复合物的高分辨率结构；
2017 年诺贝尔化学奖授予 Jacques Dubochet、Joachim Frank、Richard Henderson。

6. 其他电子显微技术

技术	原理与应用
负染（negative staining）	用重金属盐（如磷钨酸）包裹样品，样品呈亮区，适合观察病毒、蛋白纤维、微丝
免疫胶体金（immunogold）	金颗粒标记抗体，用于定位特定蛋白（如过氧化物酶体中的过氧化氢酶）
原子力显微镜（AFM）	通过探针与样品表面原子间作用力成像，可获得纳米级表面形貌
扫描隧道显微镜（STM）	利用隧道电流，可达单原子分辨率，可在低温下操纵原子

四、荧光探针与流式细胞术

1. 检测细胞内 Ca²⁺

探针	原理
水母素（aequorin）	来自水母的发光蛋白，与 Ca²⁺ 结合后发光，可检测细胞内 Ca²⁺ 变化
Fura-2	荧光染料，与 Ca²⁺ 结合后激发光谱发生偏移，可定量细胞内 Ca²⁺ 浓度

课件中展示了 Fura-2 在小脑浦肯野细胞（Purkinje cell）中显示 Ca²⁺ 浓度梯度的图像，颜色从蓝到红表示 Ca²⁺ 浓度由低到高。

2. GFP：活细胞蛋白定位的利器

来自水母（jellyfish）的绿色荧光蛋白；
发色团（chromophore）由三个氨基酸残基翻译后形成；
通过基因融合（GFP tag）可追踪目标蛋白的定位和动态；
变体：CFP（青色）、YFP（黄色）、RFP（红色）等，用于多色成像和 FRET。

3. 荧光激活细胞分选（Fluorescence-Activated Cell Sorter, FACS）

原理

细胞悬液经喷嘴形成液滴；
激光照射液滴中的细胞，检测荧光信号和散射光；
带电荷的液滴在电场中偏转，分选到不同收集管中。

应用

根据表面标志物分选特定细胞类型；
定量检测细胞内蛋白质和核酸含量；
单细胞分选用于单细胞测序。

五、同位素示踪（Isotope Probes）

1. 常用放射性同位素

同位素	半衰期	用途
\(^{32}\text{P}\)	14 天	标记 ATP、核酸
\(^{131}\text{I}\)	8.1 天	标记蛋白质（也发 γ 射线）
\(^{35}\text{S}\)	87 天	标记蛋白质（甲硫氨酸/半胱氨酸）
\(^{14}\text{C}\)	5570 年	标记有机物
\(^{45}\text{Ca}\)	164 天	标记钙
\(^{3}\text{H}\)	12.3 年	标记小分子、核苷酸

2. 脉冲-追踪实验（Pulse-Chase）

原理

脉冲（pulse）：短时间内加入放射性标记物（如 \(^{35}\text{S}\)-Met），新合成的蛋白质被标记；
追踪（chase）：洗去放射性标记，换成非放射性培养基，随时间取样；
观察放射性在不同细胞组分或不同蛋白形式中的分布变化。

经典应用

胰岛素生物合成追踪：Palade 等用脉冲-追踪结合 EM 放射自显影，证明分泌蛋白从 ER → Golgi → 分泌颗粒的运输路径；
激素分泌与受体周转：如 SRIF 分泌、TGF-β 受体（TβRII）成熟与降解。

六、细胞组分分离（Cell Fractionation）

1. 基本原理

细胞匀浆（homogenate）后，不同细胞器因大小、形状、密度不同，在离心力场中沉降速度不同，从而被分离。

2. 差速离心（Differential Centrifugation）

按离心力从小到大逐级离心，依次沉淀不同组分：

离心条件（示例）	沉淀组分
600 × g，10 min	细胞核（nuclei）
15,000 × g，5 min	线粒体、叶绿体、溶酶体、过氧化物酶体
100,000 × g，60 min	质膜、微粒体（ER 碎片）、大得多核糖体
300,000 × g，2 h	核糖体亚基、小多核糖体
上清	细胞质基质（cytosol）

3. 速度沉降 vs 平衡沉降

类型	原理	应用
速度沉降（velocity sedimentation）	在蔗糖梯度（5–20%）中按大小和形状不同沉降速度分离	分离不同大小的细胞器或复合物
平衡沉降（equilibrium sedimentation）	在陡蔗糖梯度（如 20–70%）或 CsCl 梯度中，颗粒移动到密度相等的位置	分离不同密度的细胞器（如溶酶体 1.12、线粒体 1.18、过氧化物酶体 1.23 g/cm³）

4. 免疫纯化（Immuno-purification）

用针对特定蛋白的抗体（如 anti-clathrin）结合到固相支持物上，从细胞匀浆中特异性捕获带该蛋白的囊泡或复合物（如网格蛋白包被囊泡）。

5. 无细胞体系（Cell-Free Systems）

在体外用分离的组分重建细胞过程，是研究机制的重要手段。

经典例子

Golgi 囊泡运输：Rothman 等将来自突变细胞（缺乏 GlcNAc 转移酶 I）的“供体”Golgi 与野生型“受体”Golgi 混合，加入 ATP 和细胞质，检测病毒糖蛋白是否被 \(^{3}\text{H}\)-GlcNAc 修饰，证明囊泡在 Golgi 堆叠间运输。
LC3 脂化实验：用 Atg5 敲除细胞的膜与野生型细胞质混合，加入 GTP 和 ATP，检测 LC3-I 向 LC3-II 的转化（自噬体形成的关键步骤）。

意义： 无细胞体系使复杂的细胞过程可以在受控条件下拆解分析，是细胞生物学研究的核心策略之一。

七、蛋白质纯化与检测

1. 柱层析（Column Chromatography）

类型	原理	特点
凝胶过滤（gel-filtration / size-exclusion）	多孔珠，小分子进入孔内被滞留，大分子先流出	按大小分离，大分子先出
离子交换（ion-exchange）	带电荷的珠与带相反电荷的蛋白结合，用盐梯度洗脱	按电荷分离
亲和层析（affinity）	固相上偶联特定配体（如抗体、底物、谷胱甘肽），特异结合目标蛋白	纯度最高，常作为最后一步

2. SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）

原理

SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质变性并带上均匀负电荷；
巯基乙醇（mercaptoethanol）还原二硫键；
蛋白质在电场中按分子量分离，小分子跑得快。

应用

检测蛋白质纯度；
估计分子量；
配合免疫印迹（Western blot）检测特定蛋白。

3. 等电聚焦（Isoelectric Focusing, IEF）

原理

在 pH 梯度中，蛋白质移动到其**等电点（pI）**位置时净电荷为零，不再迁移。

4. 双向凝胶电泳（2D Gel）

原理

第一维：IEF，按 pI 分离；
第二维：SDS-PAGE，按分子量分离。

应用

分离复杂蛋白质混合物（如全细胞裂解液）；
比较不同处理条件下蛋白质表达差异；
配合质谱鉴定蛋白质。

5. 免疫印迹（Immunoblotting / Western Blot）

流程

SDS-PAGE 分离蛋白质；
电转移（electrotransfer）到膜上（如硝酸纤维素膜、PVDF 膜）；
一抗孵育，识别目标蛋白；
酶标二抗孵育；
加底物显色或化学发光检测。

应用

检测特定蛋白的表达与分子量；
半定量比较不同样品中蛋白表达水平。

6. 质谱（Mass Spectrometry, MS）

原理

蛋白质酶切（如胰蛋白酶）成肽段；
肽段电离（如 MALDI 或 ESI）；
测量肽段的质荷比（m/z）；
与数据库比对，鉴定蛋白质。

应用

从 2D 胶中切取单个蛋白点进行鉴定；
大规模蛋白质组学分析；
串联质谱（MS/MS）可推断部分氨基酸序列。

八、蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interactions, PPI）

1. GST Pull-Down

原理

将目标蛋白 X 与 GST（谷胱甘肽 S-转移酶）融合表达；
融合蛋白结合到谷胱甘肽包被的珠上；
加入细胞裂解液，与 X 互作的蛋白被捕获；
用谷胱甘肽洗脱，SDS-PAGE 检测。

应用

体外验证已知或推测的蛋白互作；
筛选互作蛋白。

2. FRET（荧光共振能量转移）

原理

两个荧光蛋白（如 CFP 和 YFP）分别融合到蛋白 X 和 Y；
当 X 和 Y 距离足够近（<10 nm）时，激发 CFP 可导致 YFP 发射荧光（能量转移）；
检测 YFP 荧光即可判断互作。

应用

活细胞中实时监测蛋白互作；
检测构象变化。

3. 酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid）

原理

将诱饵蛋白（bait）与 DNA 结合域（BD）融合；
将猎物蛋白（prey）与转录激活域（AD）融合；
若 bait 与 prey 互作，BD 与 AD 靠近，激活报告基因表达。

应用

筛选 cDNA 文库中的互作蛋白；
验证已知互作。

4. 噬菌体展示（Phage Display）

原理

将外源肽段或蛋白与噬菌体外壳蛋白融合，展示在噬菌体表面；
用靶分子（如抗体、受体）筛选结合的噬菌体；
回收并测序，获得编码序列。

应用

筛选特异性结合肽或抗体；
课件例子：将噬菌体文库注射到脑肿瘤小鼠体内，筛选能特异性结合肿瘤血管的肽段。

5. 表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR / Biacore）

原理

将诱饵分子固定在金膜表面；
流入猎物分子溶液；
分子结合改变金膜表面折射率，导致共振角变化；
实时监测结合（association）和解离（dissociation）曲线，计算 \(K_d\)。

应用

定量测定蛋白-蛋白、蛋白-小分子、抗原-抗体的结合亲和力；
无需标记，实时检测。

九、分子生物学与遗传学方法

1. 定点突变（Site-Directed Mutagenesis）

原理

设计含突变碱基的寡核苷酸引物；
以质粒模板进行 PCR 扩增；
DNA 聚合酶延伸、连接酶封闭；
转化细胞，筛选含突变基因的克隆。

应用

研究特定氨基酸对蛋白功能的影响；
构建点突变疾病模型。

2. 将物质导入细胞

方法	原理
显微注射（microinjection）	玻璃微针直接注射到细胞质或细胞核
电穿孔（electroporation）	短暂电脉冲在膜上形成瞬时可逆孔道
脂质体介导（lipid-mediated）	脂质体与质膜融合，将内容物释放到细胞质
金颗粒介导（gold particle-mediated / gene gun）	DNA 包被金颗粒，高压射入细胞

3. 异位过表达（Ectopic Misexpression）

在非正常位置或时间表达某基因，观察表型变化。

课件例子

Wnt 异位表达：在胚胎中异位表达 Wnt，导致形成第二体轴；
Dapper2 过表达：在斑马鱼中过表达 Dapper2，导致眼睛融合（eye fusion），证明其在发育中的作用（Zhang et al., 2004, Science）。

4. RNA 干扰（RNA Interference, RNAi）

原理

双链 RNA（dsRNA）被 Dicer 切割成小干扰 RNA（siRNA）；
siRNA 与 RISC 复合物结合，降解同源 mRNA；
导致基因表达敲低（knockdown），而非完全敲除。

形式

siRNA：体外合成，直接导入细胞，瞬时敲低；
shRNA：通过载体在细胞内表达短发夹 RNA，可稳定敲低。

应用

研究基因功能；
课件例子：线虫（C. elegans）中通过喂食表达 dsRNA 的 E. coli 实现基因敲低。

5. 基因敲除、敲入与替换

类型	结果
基因替换（gene replacement）	用突变基因替换正常基因，只有突变基因有活性
基因敲除（gene knockout）	破坏目标基因，使其无活性
基因添加（gene addition）	在基因组中额外插入一个基因，正常基因和额外基因都有活性

6. 基因敲除小鼠的制备

流程

构建含同源臂的替换载体（含 neo\(^r\) 正筛选标记和 tk\(^{HSV}\) 负筛选标记）；
电穿孔导入 ES 细胞；
同源重组（homologous recombination）：目标基因被破坏；
随机插入（nonhomologous recombination）：tk 基因插入，细胞对 ganciclovir 敏感；
用 neomycin（正筛选）和 ganciclovir（负筛选）筛选；
将正确重组的 ES 细胞注射到囊胚腔；
产生嵌合体小鼠（chimeric mice）；
与野生型小鼠交配，获得杂合子；
杂合子互交，获得纯合敲除小鼠。

7. 条件性敲除：LoxP-Cre 系统

原理

LoxP：34 bp 的 DNA 识别位点；
Cre 重组酶：来自 P1 噬菌体，识别 LoxP 位点并介导重组；
将 LoxP 位点置于目标基因两侧（floxed 基因）；
在表达 Cre 的细胞中，LoxP 位点间的序列被切除，实现组织特异性或时间特异性敲除。

应用

研究特定组织或发育阶段中基因的功能；
避免全身敲除导致的胚胎致死。

8. CRISPR/Cas9 基因编辑

原理

Cas9：核酸内切酶，在 guide RNA（gRNA）引导下切割目标 DNA；
gRNA：与目标 DNA 互补配对（约 20 nt）；
切割后通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）实现基因敲除或敲入。

优点

操作简单、效率高、可同时编辑多个基因；
2020 年诺贝尔化学奖授予 Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer Doudna。

9. RNA-seq

原理

提取 mRNA；
片段化；
反转录为 cDNA；
加接头、PCR 扩增；
高通量测序（如 Illumina）；
比对到参考基因组，定量基因表达。

应用

同时监测数千个基因的表达；
比较不同处理、不同发育阶段或不同疾病状态的转录组差异；
聚类分析（clustering）可发现共表达基因模块（如胆固醇合成、细胞周期、伤口愈合相关基因）。

十、模式生物（Model Organisms）

模式生物	研究优势	主要应用
病毒（viruses）	结构简单、基因组小	DNA/RNA/蛋白质合成、基因调控、癌症、基因治疗
细菌（bacteria）	繁殖快、遗传操作方便	DNA/RNA/蛋白质合成、代谢、抗生素靶点、细胞周期、信号转导
*酵母（S. cerevisiae）*	真核生物、遗传操作成熟	细胞周期、蛋白质分泌、膜生物发生、细胞骨架、衰老、基因调控
*线虫（C. elegans）*	细胞数目恒定、谱系清楚	体轴发育、细胞谱系、神经系统、程序性细胞死亡、衰老、行为
*果蝇（D. melanogaster）*	遗传学经典、发育机制保守	体轴发育、细胞分化、神经系统、心脏、肌肉、程序性细胞死亡、癌症基因、行为
*斑马鱼（D. rerio）*	脊椎动物、胚胎透明、体外发育	脊椎动物组织发育、脑和神经系统、出生缺陷、癌症
*小鼠（M. musculus）*	哺乳动物、与人类亲缘近	组织发育、免疫系统、脑和神经系统、人类疾病模型、基因调控、传染病
*拟南芥（A. thaliana）*	植物模式生物、基因组小	植物组织发育、细胞生物学遗传学、农业应用、生理、免疫

保守基因的例子

Hox 基因：在果蝇和哺乳动物中均控制体轴发育；
Pax6 / eyeless：果蝇的 eyeless 基因与哺乳动物的 Pax6 同源，均控制眼睛发育；人类 PAX6 突变导致无虹膜症（aniridia）。

意义： 模式生物研究表明，许多控制发育和细胞过程的基因在进化中高度保守，因此可以从简单生物的研究推及人类。

十一、本章关键点总结

主题	核心要点
光学显微镜	明场、相差、DIC、暗场；荧光显微镜；共聚焦排除焦外光；超分辨率（SIM、STORM）
电子显微镜	TEM 看内部超微结构；SEM 看表面形貌；冷冻蚀刻看膜内结构；cryo-EM 解析大分子结构
荧光探针	GFP 标记蛋白；fura-2 检测 Ca²⁺；FACS 分选细胞
同位素	\(^{32}\text{P}\) 标记核酸/ATP；\(^{35}\text{S}\) 标记蛋白；脉冲-追踪研究动态过程
细胞组分分离	差速离心按大小分离；密度梯度离心按密度分离；无细胞体系重建细胞过程
蛋白质纯化	凝胶过滤按大小；离子交换按电荷；亲和层析按特异结合；SDS-PAGE 按分子量
蛋白质检测	Western blot 检测特定蛋白；质谱鉴定蛋白质
蛋白质互作	GST pull-down（体外）、FRET（活细胞）、酵母双杂交（筛选）、噬菌体展示（筛选）、SPR（定量亲和力）
基因功能研究	定点突变、RNAi 敲低、基因敲除/敲入、LoxP-Cre 条件敲除、CRISPR/Cas9 编辑、RNA-seq 转录组分析
模式生物	病毒、细菌、酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、拟南芥；基因功能高度保守

十二、复习自测题

比较明场、相差、DIC、暗场四种光学显微技术的原理和适用场景。
荧光显微镜的光路中，激发滤光片、二向色镜和发射滤光片各起什么作用？
共聚焦显微镜为什么能获得清晰的光学切片？它与普通荧光显微镜的关键区别是什么？
TEM 和 SEM 的成像原理有何不同？各自适合观察什么结构？
冷冻蚀刻技术为什么能显示膜内蛋白颗粒？P 面和 E 面分别代表什么？
差速离心分离细胞器时，细胞核、线粒体、微粒体、核糖体分别在哪一级沉淀？
速度沉降和平衡沉降的区别是什么？各自根据什么物理量分离？
凝胶过滤、离子交换、亲和层析分别按什么原理分离蛋白质？哪一种纯度最高？
SDS-PAGE 中 SDS 和巯基乙醇各起什么作用？蛋白质按什么顺序迁移？
GST pull-down、FRET、酵母双杂交、噬菌体展示、SPR 各适合研究蛋白质互作的哪个方面？
基因敲除（knockout）和基因敲低（knockdown）有什么区别？各自常用什么方法实现？
LoxP-Cre 系统如何实现组织特异性基因敲除？与全身敲除相比有什么优势？
CRISPR/Cas9 的基本原理是什么？gRNA 和 Cas9 各起什么作用？
为什么模式生物的研究结果可以推及人类？请举一个保守基因的例子。

十三、解答

比较明场、相差、DIC、暗场四种光学显微技术的原理和适用场景。

· 明场 (Bright-field)：光直接透射过样品。对比度低，适合观察染色后的固定样品。 · 相差 (Phase-contrast)：将光通过透明样品产生的相位差转换为亮度差。适合观察未染色的活细胞内部结构。 · DIC (微分干涉)：利用偏振光分成两束相干光再干涉。呈现浮雕感（厚度差），适合观察活细胞动态。 · 暗场 (Dark-field)：只收集样品侧面散射的光。背景暗、样品亮，适合观察未染色的透明微小结构。

荧光显微镜的光路中，激发滤光片、二向色镜和发射滤光片各起什么作用？

· 激发滤光片 (Excitation filter)：只允许特定波长的激发光通过，阻挡其他波长。 · 二向色镜 (Dichroic mirror)：反射短波长的激发光至样品，透射长波长的发射光。 · 发射滤光片 (Emission filter)：只允许特定波长的发射荧光通过，彻底阻挡残余的激发光。

共聚焦显微镜为什么能获得清晰的光学切片？它与普通荧光显微镜的关键区别是什么？

· 原理：共聚焦显微镜在检测器前有一个针孔 (Pinhole)，只允许来自焦平面的光通过，阻挡了焦外上下层的杂散光。 · 关键区别：普通荧光显微镜收集整个深度的光导致图像模糊；共聚焦能进行逐层扫描（Z-stack），获得极薄的清晰光学切片，并可进行三维重建。

TEM 和 SEM 的成像原理有何不同？各自适合观察什么结构？

· TEM (透射电镜)：电子束穿过超薄切片，电子密度高的区域散射电子呈暗区。适合观察细胞内部的超微结构。 · SEM (扫描电镜)：电子束扫描样品表面，收集二次电子成像。样品需喷镀金属。适合观察细胞或组织的表面 3D 形貌。

冷冻蚀刻技术为什么能显示膜内蛋白颗粒？P 面和 E 面分别代表什么？

· 原理：样品冷冻后用刀劈裂，断裂面往往沿着脂双层疏水核心（中间）裂开，从而暴露出嵌在膜内的蛋白颗粒。 · P 面 (Protoplasmic face)：靠近细胞质侧的内层小叶（含蛋白颗粒多）。 · E 面 (Ectoplasmic face)：靠近细胞外侧或内腔侧的外层小叶。

差速离心分离细胞器时，细胞核、线粒体、微粒体、核糖体分别在哪一级沉淀？

· 细胞核：最低转速（如 600g）。 · 线粒体：中等转速（如 15,000g）。 · 微粒体 (ER碎片)：较高转速（如 100,000g）。 · 核糖体：最高转速（如 300,000g）。

速度沉降和平衡沉降的区别是什么？各自根据什么物理量分离？

· 速度沉降：在较浅的梯度中，根据颗粒的大小和形状不同（沉降系数不同）进行分离。 · 平衡沉降：在陡峭的密度梯度中，颗粒下沉或上浮直到到达与其自身密度相等的位置悬浮。

凝胶过滤、离子交换、亲和层析分别按什么原理分离蛋白质？哪一种纯度最高？

· 凝胶过滤：按分子大小分离（大分子进不去孔，先洗脱）。 · 离子交换：按表面电荷差异分离。 · 亲和层析：按特异性生物相互作用（如抗原-抗体、酶-底物）分离。 · 纯度最高：亲和层析（通常作为最后一步纯化）。

SDS-PAGE 中 SDS 和巯基乙醇各起什么作用？蛋白质按什么顺序迁移？

· SDS：使蛋白质变性，并赋予多肽链均匀的负电荷，消除了不同蛋白质之间的电荷差异。 · 巯基乙醇：还原并破坏二硫键，使蛋白质完全解折叠为线性多肽。 · 迁移顺序：按分子量大小分离，分子量越小的多肽在凝胶中迁移得越快（越靠下）。

GST pull-down、FRET、酵母双杂交、噬菌体展示、SPR 各适合研究蛋白质互作的哪个方面？

· GST pull-down：体外验证或寻找与已知诱饵蛋白直接互作的蛋白。 · FRET：活细胞内实时监测蛋白-蛋白空间距离或互作。 · 酵母双杂交：活细胞内高通量筛选未知的互作蛋白（cDNA文库）。 · 噬菌体展示：高通量筛选特异性结合靶标的多肽或抗体。 · SPR (Biacore)：定量测定分子间的结合亲和力（K_d）及动力学常数（结合/解离速率）。

基因敲除（knockout）和基因敲低（knockdown）有什么区别？各自常用什么方法实现？

· Knockout (敲除)：通过DNA层面的改变，彻底破坏基因序列，导致蛋白完全不表达。常用方法：同源重组（ES细胞打靶）、CRISPR/Cas9。 · Knockdown (敲低)：在RNA或翻译层面抑制表达，降低蛋白水平但不清零。常用方法：RNA干扰（siRNA, shRNA）。

LoxP-Cre 系统如何实现组织特异性基因敲除？与全身敲除相比有什么优势？

· 原理：将目标基因两侧装入 LoxP 位点（floxed 小鼠），与表达组织特异性启动子驱动的 Cre 重组酶转基因小鼠交配。Cre 酶只在特定组织中表达，从而仅切除该组织中的目标基因。 · 优势：避免全身敲除导致的胚胎致死；可研究特定成体组织或细胞中基因的功能。

CRISPR/Cas9 的基本原理是什么？gRNA 和 Cas9 各起什么作用？

· 原理：利用细菌的获得性免疫机制进行基因编辑。 · gRNA (引导RNA)：识别并结合靶标 DNA 序列（通过碱基互补配对）。 · Cas9 (核酸内切酶)：在 gRNA 的引导下，在靶标 DNA 上产生双链断裂，诱发细胞进行非同源末端连接（NHEJ，导致敲除）或同源定向修复（HDR，用于敲入）。

为什么模式生物的研究结果可以推及人类？请举一个保守基因的例子。

· 原因：生命进化具有高度的保守性。许多控制基本细胞活动（如细胞周期、代谢）和早期发育的基因在真核生物乃至更广的物种间高度相似。 · 例子：Hox 基因在果蝇和哺乳动物中都控制体轴的发育；Pax6/eyeless 基因控制眼睛发育（果蝇 eyeless 与人类 PAX6 突变导致无虹膜症）。

参考文献与延伸阅读

Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell, 7th Ed. W. W. Norton & Company, 2022.
Lodish, H., et al. Molecular Cell Biology, 9th Ed. W. H. Freeman, 2021.
丁明孝、王喜忠、张传茂、陈建国主编，《细胞生物学》（第五版），高等教育出版社，2020.
陈晔光、陈建国主编，《细胞生物学》，高等教育出版社，2025.
Rothman, J. E. (2014). The principle of membrane fusion in the cell (Nobel Lecture). Angewandte Chemie International Edition, 53(47), 12676–12694.
Zhang, M., et al. (2020). A translocated channel for unconventional protein secretion. Cell, 182(4), 917–932.

说明： 侧重于每种方法“为什么这样设计”和“能解决什么问题”，具体操作步骤仅作简要说明。考试中若涉及方法选择，应从样品类型（活细胞/固定样品）、分辨率需求、是否需要标记、是否定量等角度分析。

细胞生物学学习笔记 1 | 细胞概论：从细胞学说 to 原核与真核

Sat, 17 Oct 2026 01:00:00 +0000

细胞生物学学习笔记 1 | 细胞概论：从细胞学说 to 原核与真核

对应课件： Lecture 1 - Intro 2026
本章核心内容： 细胞生物学研究范围、细胞学说、细胞作为生命基本单位的依据、细胞的基本属性、细胞大小的限制因素、原核与真核细胞的区别、原核生物、病毒、真核细胞的进化
复习目标： 掌握细胞学说三条基本原则；理解细胞为什么是生命的基本单位；能对比原核细胞与真核细胞的主要差异；了解病毒的基本特征及内共生学说。

一、细胞生物学研究什么？

细胞生物学（Cell Biology）研究细胞的结构（structures）、功能（functions）及其调控（regulation）。细胞是生命的最小单位，连接分子（molecules）与复杂组织器官（tissues and organs）。

课件中列出的热点研究领域包括：

研究方向	具体内容举例
细胞周期与 DNA 损伤	cell cycle checkpoint, DNA damage and repair
信号转导	signal transduction
膜运输与细胞器	membrane trafficking, organelle biology, degradation
细胞运动与分化	cell motility, cell differentiation, cell death
干细胞与单细胞生物学	stem cell, single cell biology, cell atlas
表观遗传与 RNA 生物学	epigenetics, miRNA, ncRNA
组学与系统生物学	genomics, proteomics, bioinformatics, systems biology
合成生物学与成像	synthetic biology, single molecule imaging

与细胞生物学密切相关的主要疾病包括癌症（cancer）、心血管疾病（cardiovascular diseases）、糖尿病等代谢性疾病（diabetes and metabolic diseases），以及 AIDS、肝炎、流感、埃博拉、Zika、SARS-CoV-2 等传染病。

二、细胞学说（Cell Theory）

1. 发现历程

时间	人物	贡献
1665	Robert Hooke	首次报告“细胞”——观察的是死软木组织的空细胞壁，命名 cellulae（小房间）
1674	Anton van Leeuwenhoek	描述细胞核和细菌（活细胞观察）
1838	Mathias Schleiden	植物由细胞构成，植物从单个细胞发育而来
1839	Theodor Schwann	提出细胞学说两条原则
1855	Rudolf Virchow	提出第三条原则：细胞只能来自已有细胞的分裂

2. 细胞学说三条基本原则

所有生物体由一个或多个细胞组成。
All organisms are composed of one or more cells.
细胞是所有生物体结构和功能的基本单位。
Cells are the basic units of structure and function for all organisms.
所有细胞只能来自先前存在的细胞分裂。
All cells arise only from preexisting cells by division.

易错点： Schwann 曾提出“blastema”（无结构物质）概念，认为细胞可以从这种物质中形成。Virchow 的“omnis cellula e cellula”（每个细胞来自另一个细胞）终结了这一错误观点。值得注意的是，这句格言最早由 François Vincent Raspail 在 1825 年提出，Virchow 将其发展为细胞病理学体系。

3. 细胞学说建立后的重要发现

Flemming 和 Strasburger 分别发现动物和植物细胞的有丝分裂（mitosis）
Van Beneden（1883）和 Strasburger（1886）分别发现动物和植物细胞的减数分裂（meiosis）
Van Beneden 和 Boveri（1883）发现着丝粒（centromere）
Altmann（1894）发现线粒体（mitochondria）
Camillo Golgi（1898）发现高尔基体（Golgi apparatus）
Claude、de Duve、Palade 因细胞器发现获 1974 年诺贝尔生理学或医学奖

三、为什么细胞是生命的基本单位？

角度	说明
结构单位	所有生物体都由细胞组成（神经细胞、红细胞、骨细胞、肌细胞、上皮细胞等）
功能单位	所有代谢活动都基于细胞
繁殖与遗传	细胞是繁殖的基础，也是遗传的桥梁
生长发育	一个受精卵可发育为约 \(3\times10^{13}\) 个细胞、210 种细胞类型的人体
全能性	细胞具有全能性（totipotent），可产生同类型的新个体

全能性与克隆实验

胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES cells）：来自囊胚内细胞团（inner cell mass），具有多能性（pluripotent），可分化为中胚层、内胚层、外胚层，并具备自我更新（self-renewal）能力。
核移植实验：John B. Gurdon（1968, Oxford；2012 诺贝尔奖）将蝌蚪肠细胞核移植到去核卵母细胞中，部分可发育为游泳蝌蚪，证明高度分化的细胞仍保留完整基因组。
Dolly 羊：1997 年 Ian Wilmut 等从成年细胞克隆出第一只动物，证明动物体细胞核具有全能性。
iPS 细胞：Yamanaka 发现 Oct4、Sox2、Klf4、Myc 四个因子可将小鼠和成人成纤维细胞诱导为多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells），获 2012 诺贝尔奖。

思考： “多能性（pluripotent）”与“全能性（totipotent）”不同。受精卵和早期卵裂球是 totipotent，可形成完整个体及胚外组织；ES 细胞是 pluripotent，可形成三个胚层但不能单独形成完整个体。

四、细胞的基本属性

高度复杂且有序，能合成和降解大量分子与结构；
拥有遗传程序（genetic program）并具备使用该程序的能力；
能自我繁殖；
能获取和利用能量；
能进行多种化学反应和机械活动（如形状改变、运动）；
能响应刺激，感知和传递信息；
能自我调节，根据需求调节基因表达；
会死亡——或因外部损伤，或因内部程序性死亡（programmed cell death）。

所有细胞的共同结构基础

尽管原核与真核细胞差异巨大，所有细胞共享：

质膜（plasma membrane）
DNA/RNA
核糖体（ribosome）

记忆点： 膜、核酸、核糖体是细胞最基本的“通用装备”。

五、细胞的大小

1. 单位

微米：\(1\ \mu\text{m} = 10^{-6}\ \text{m}\)
纳米：\(1\ \text{nm} = 10^{-9}\ \text{m}\)

2. 细胞大小受限的原因

限制因素	解释
核质比（nucleus/cytoplasm ratio）	细胞核能控制的细胞质体积有限
表面积/体积比（surface area/volume ratio）	细胞越大，表面积相对越小，物质交换效率下降
扩散效率	物质通过细胞质扩散的速度有限，细胞过大则内部运输困难

3. 尺度感

课件中的尺度图可作为复习参考：

结构	大致尺寸
原子	0.1 nm
小分子	~1 nm
蛋白质	1–100 nm
核糖体	25–30 nm
病毒	20–300 nm
细菌	1–2 μm
线粒体	1–2 μm
真核细胞	10–100 μm
细胞核	5–10 μm

注意： 光学显微镜分辨率约 0.2 μm，因此大多数细胞器需要电子显微镜才能看清。荧光显微镜和共聚焦显微镜可提高对比度和三维重建能力。

六、原核细胞与真核细胞

1. 基本区分

特征	原核细胞（prokaryotes）	真核细胞（eukaryotes）
出现时间	约 35 亿年前	约 15 亿年前
核膜	无真正的核膜，仅有拟核（nucleoid）	有真正的细胞核（nucleus）
DNA 包装	单个“裸露”DNA 染色体，不与组蛋白形成核小体	多条染色体，DNA 与蛋白质结合
膜性细胞器	无	有（ER、Golgi、溶酶体、线粒体等）
细胞骨架	无（或仅有类似结构）	有（微丝、微管、中间丝）
核糖体大小	70S	80S（线粒体和叶绿体为 70S）
细胞分裂	简单二分裂（binary fission）	有丝分裂（mitosis）
鞭毛结构	鞭毛蛋白（flagellin），质子驱动，旋转式	微管蛋白（tubulin），ATP 驱动，摆动式，有膜包裹
典型代表	细菌、古菌	原生生物、真菌、植物、动物

2. 原核细胞与真核细胞鞭毛的区别（易考）

特征	细菌鞭毛	真核鞭毛
主要蛋白	flagellin	tubulin
能量来源	质子动力势（proton motive force）	ATP
运动方式	旋转（rotor）	摆动（bending）
是否被质膜包裹	否（outside）	是（covered with PM）
结构	钩状体+基体	9+2 微管轴丝

3. 植物细胞与动物细胞的区别

植物细胞特有：

细胞壁（cell wall）
叶绿体（chloroplast）
大液泡（large vacuole）

动物细胞特有：

中心体（centrosome）（多数植物细胞无）
溶酶体（lysosome）（植物细胞中类似功能由液泡承担）

两者都有：质膜、细胞核、ER、Golgi、线粒体、核糖体、细胞骨架。

七、原核生物（Prokaryotes）

1. 三域系统

生命之树有三个主要分支：

古菌（Archaea）
细菌（Bacteria）
真核生物（Eukarya）

大多数细菌和古菌有 1000–4000 个基因。

2. 最小的细胞

支原体（Mycoplasma）：0.1–0.3 μm
最小基因组：约 482 个基因
最小必需基因（minimal essential genes）：约 256 个

思考： “最小必需基因”是通过转座子突变和基因组比较推算出的维持生命所需的最少基因集，对合成生物学（synthetic biology）有重要意义。

八、病毒（Viruses）

1. 基本特征

特征	说明
定义	严格胞内寄生（obligatory intracellular parasites）
遗传物质	单链或双链 DNA 或 RNA
结构	核酸 + 蛋白质衣壳（capsid），部分有脂质包膜（envelope）
大小	约 20–300 nm
感染类型	裂解性感染（lytic infection）、整合性感染（integrated infection）

2. 病毒与细胞的区别

特征	病毒	细胞
能否独立代谢	不能	能
能否独立繁殖	不能（需宿主）	能
是否有核糖体	无	有
是否有细胞膜	部分有包膜，但非细胞膜	有质膜
遗传物质	DNA 或 RNA	DNA（少数例外）

3. 病毒起源假说

病毒起源于宿主进化之后；
病毒可能起源于宿主染色体片段。

4. 类病毒与朊病毒

类病毒（viroids）：感染性 RNA，无蛋白质外壳。
朊病毒（prions）：感染性蛋白质，可引起克雅氏病（CJD）、牛海绵状脑病（BSE）等。

易错点： 病毒不是细胞，不属于原核或真核生物。分类上独立于三域系统之外。

九、真核细胞的进化

1. 内共生学说（Endosymbiotic Theory）

真核细胞可能起源于一个古菌宿主细胞吞噬了好氧细菌，后者演化为线粒体；随后某些细胞又吞噬了光合细菌，演化为叶绿体。

事件	证据
线粒体起源	线粒体有双层膜、环状 DNA、70S 核糖体，大小和形态类似细菌
叶绿体起源	叶绿体有双层膜、环状 DNA、70S 核糖体，类似蓝细菌
古菌宿主	Asgard 古菌（2020 年 Nature 论文）具有类似真核细胞的膜突起结构

2. 演化顺序

厌氧古菌（anaerobic archaeon）
获得好氧细菌共生体 → 线粒体（mitochondria）
形成早期真核细胞
部分谱系获得光合细菌 → 叶绿体（chloroplasts）
分化出植物、动物、真菌等谱系

3. 关键证据

线粒体和叶绿体有独立的环状 DNA；
有 70S 核糖体，对细菌抗生素敏感；
双层膜结构；
分裂方式类似细菌二分裂；
系统发育分析显示线粒体与 α-变形菌相关，叶绿体与蓝细菌相关。

注意： 内共生学说解释的是线粒体和叶绿体的起源，而非细胞核的起源。细胞核的起源仍有多种假说（如 invagination 假说、viral eukaryogenesis 假说等）。

十、本章关键点总结

主题	核心要点
细胞学说	三条原则：生物体由细胞组成；细胞是结构和功能单位；细胞来自已有细胞
细胞是基本单位	结构、功能、繁殖、遗传、发育、全能性六个维度
细胞基本属性	复杂有序、遗传程序、自我繁殖、能量利用、代谢活动、响应刺激、自我调节、死亡
细胞大小	受核质比、表面积/体积比、扩散效率限制
原核 vs 真核	核膜、膜性细胞器、DNA 包装、核糖体大小、分裂方式、鞭毛结构
原核生物	古菌和细菌两个亚界；支原体是最小细胞
病毒	严格胞内寄生；DNA 或 RNA；裂解性/整合性感染；不属于细胞
真核细胞进化	内共生学说：线粒体来自好氧细菌，叶绿体来自光合细菌

十一、复习自测题

细胞学说的三条原则分别由谁提出？Schwann 的“blastema”概念错在哪里？
为什么细胞不能无限增大？请从核质比、表面积/体积比和扩散效率三个角度解释。
列表比较原核细胞与真核细胞在核膜、DNA 包装、膜性细胞器、核糖体、分裂方式和鞭毛结构上的差异。
病毒为什么不属于细胞？病毒与朊病毒、类病毒有何区别？
内共生学说的主要证据有哪些？线粒体和叶绿体分别可能起源于哪类细菌？
什么是 iPS 细胞？它与 ES 细胞在“多能性”上有何异同？

十二、解答

1. 细胞学说的三条原则分别由谁提出？Schwann 的“blastema”概念错在哪里？

提出者：
1. 所有生物体由一个或多个细胞组成 —— Schleiden & Schwann (1838-1839)
2. 细胞是所有生物体结构和功能的基本单位 —— Schleiden & Schwann (1838-1839)
3. 所有细胞只能来自先前存在的细胞分裂 —— Rudolf Virchow (1855)
Blastema 概念的错误： Schwann 曾提出一种“无结构物质”（blastema），认为细胞可以从这种物质中自发形成。这实际上是一种自然发生论（spontaneous generation）。Virchow 提出的“Omnis cellula e cellula”（每个细胞来自另一个细胞）彻底否定了这一错误观点，确立了细胞只能由已有细胞分裂而来的原则。

2. 为什么细胞不能无限增大？请从核质比、表面积/体积比和扩散效率三个角度解释。

核质比（Nucleus/Cytoplasm ratio）：细胞核的控制能力有限。当细胞体积过大时，单个细胞核无法产生足够的 mRNA 和调控因子来维持整个细胞质的正常代谢。
表面积/体积比（Surface area/Volume ratio）：体积随线性尺寸的立方增加，而表面积仅随平方增加。细胞越大，相对表面积越小，跨膜的物质交换效率无法满足庞大细胞内部的需求。
扩散效率（Diffusion efficiency）：物质在细胞质基质中的扩散速度有限。细胞过大，物质扩散到细胞内部所需的时间过长，限制了生化反应的速率。

3. 列表比较原核细胞与真核细胞的主要差异

特征	原核细胞 (Prokaryotes)	真核细胞 (Eukaryotes)
核膜	无，仅有拟核（nucleoid）区	有真正的双层核膜包被的细胞核
DNA 包装	单个环状裸露 DNA，不与组蛋白结合	多个线状 DNA，与组蛋白结合形成染色质
膜性细胞器	无（无 ER、Golgi、溶酶体、线粒体等）	有（内膜系统、线粒体、叶绿体等）
核糖体	70S（沉降系数）	80S（线粒体/叶绿体内部为 70S）
分裂方式	简单二分裂（binary fission）	有丝分裂（mitosis）和减数分裂（meiosis）
鞭毛结构	鞭毛蛋白（flagellin），质子驱动，旋转式，无膜包裹	微管蛋白（tubulin），ATP驱动，摆动式，有质膜包裹

4. 病毒为什么不属于细胞？病毒与朊病毒、类病毒有何区别？

病毒不属于细胞的原因：病毒没有细胞结构（无质膜、无核糖体、无代谢系统），不能独立进行代谢和繁殖，属于严格的胞内寄生生物（obligate intracellular parasites）。
区别：
- 病毒 (Virus)：由核酸（DNA或RNA）和蛋白质衣壳组成，部分有脂质包膜。
- 类病毒 (Viroid)：仅由具有感染性的游离 RNA 分子组成，无蛋白质外壳。
- 朊病毒 (Prion)：仅由具有感染性的错误折叠蛋白质组成，不含核酸（引起克雅氏病、疯牛病等）。

5. 内共生学说的主要证据有哪些？线粒体和叶绿体分别可能起源于哪类细菌？

主要证据：
1. 双层膜结构（外膜源于宿主吞噬，内膜源于被吞噬细菌）。
2. 拥有独立的环状 DNA，类似于细菌的拟核。
3. 拥有自己的 70S 核糖体，且对细菌抗生素敏感。
4. 通过类似于细菌二分裂的方式进行增殖。
5. 基因测序证明其序列与原核生物高度同源。
起源：
- 线粒体起源于好氧的 α-变形菌（α-proteobacteria）。
- 叶绿体起源于光合蓝细菌（cyanobacteria）。

6. 什么是 iPS 细胞？它与 ES 细胞在“多能性”上有何异同？

iPS 细胞（诱导多能干细胞）：通过导入特定的转录因子（Yamanaka 四因子：Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc），将已分化的成体细胞（如成纤维细胞）重编程，使其逆转为类似胚胎干细胞的状态。
异同：
- 相同点：两者都具有多能性（pluripotent），能够自我更新，并能分化为三个胚层（内、中、外胚层）的几乎所有细胞类型。
- 不同点：**ES 细胞（胚胎干细胞）**来源于早期胚胎（囊胚内细胞团），提取涉及破坏胚胎，存在伦理争议；iPS 细胞来源于患者自身体细胞，回避了伦理问题，且可用于自体移植（个性化医疗），但可能存在一定的表观遗传记忆。

参考文献与延伸阅读

Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell, 7th Ed. W. W. Norton & Company, 2022.
Lodish, H., et al. Molecular Cell Biology, 9th Ed. W. H. Freeman, 2021.
丁明孝、王喜忠、张传茂、陈建国主编，《细胞生物学》（第五版），高等教育出版社，2020.
陈晔光、陈建国主编，《细胞生物学》，高等教育出版社，2025.
Imachi, H., et al. (2020). Isolation of an archaeon at the prokaryote–eukaryote interface. Nature, 577, 519–525.

笔记说明： 课件中标注的“热点领域”和“主要疾病”仅作了解，考试重点应放在细胞学说、原核与真核细胞比较、病毒基本特征和内共生学说上。