细胞生物学学习笔记 2 | 细胞生物学研究方法：从显微成像到基因编辑

Sun, 18 Oct 2026 04:00:00 +0000

细胞生物学学习笔记 2 | 细胞生物学研究方法：从显微成像到基因编辑

对应课件： Lecture 2 - Methods 2026
本章核心内容： 荧光显微与电子显微技术、荧光探针与流式细胞术、同位素示踪、细胞组分分离、蛋白质纯化与检测、蛋白质互作研究方法、分子生物学与遗传学方法、模式生物
复习目标： 掌握各类显微技术的原理与适用场景；理解细胞组分分离与蛋白质纯化的基本策略；能区分检测蛋白质互作的不同方法；熟悉基因功能研究的常用手段（敲除、敲低、敲入、CRISPR）。

一、本章总览：研究细胞的方法体系

主线：

研究目的	主要方法
观察细胞	光学显微镜（明场、相差、DIC、暗场、荧光、共聚焦）、电子显微镜（TEM、SEM、冷冻蚀刻、cryo-EM）
标记与追踪	荧光探针（GFP、fura-2、DAPI）、同位素（\(^{32}\text{P}\)、\(^{35}\text{S}\)、\(^{3}\text{H}\)）、脉冲-追踪（pulse-chase）
分离细胞器	细胞组分分离（差速离心、密度梯度离心）
纯化与检测蛋白质	柱层析、SDS-PAGE、等电聚焦、2D 电泳、免疫印迹、质谱
研究蛋白质互作	GST pull-down、FRET、酵母双杂交、噬菌体展示、SPR（Biacore）
研究基因功能	定点突变、RNAi、基因敲除/敲入、LoxP-Cre、CRISPR/Cas9、RNA-seq

考试提示： 每种方法的原理和主要应用是重点，而不是具体操作细节。

二、光学显微镜（Light Microscopy）

1. 分辨率基础

光学显微镜的最大分辨率约为 0.2 μm（200 nm），受可见光波长限制。这决定了它能看到细胞整体、细胞核、染色体等较大结构，但看不到核糖体、膜结构细节。

2. 四种观察活细胞的光学显微技术

技术	原理	特点与适用场景
明场（bright-field）	光直接透射过样品	最简单，对比度低，适合染色后的固定样品
相差（phase-contrast）	将光通过透明样品产生的相位差转换为亮度差	可观察未染色活细胞，能看清细胞内部结构
微分干涉（DIC / Nomarski）	偏振光分成两束相干光，经样品后重新组合产生干涉	细胞有浮雕感，适合观察活细胞动态
暗场（dark-field）	只检测样品侧面散射的光	背景暗、样品亮，适合观察未染色透明样品

记忆点： 相差看“密度差”，DIC 看“厚度差”（浮雕感），暗场看“散射光”。

3. 荧光显微镜（Fluorescence Microscopy）

基本原理

荧光分子吸收特定波长（激发光，excitation）后，发射更长波长（发射光，emission）的光。荧光显微镜通过滤光片系统分离激发光和发射光。

光路关键部件

部件	功能
第一滤光片（excitation filter）	只让特定波长的激发光通过（如 450–490 nm 蓝光）
二向色镜（beam-splitting mirror / dichroic mirror）	反射短波长激发光到样品，透射长波长发射光
第二滤光片（emission filter / barrier filter）	只让特定发射光通过，阻挡残余激发光

常用荧光染料与蛋白

荧光基团	激发/发射（约）	用途
DAPI	358 / 461 nm	染 DNA（细胞核）
GFP	488 / 507 nm	蛋白定位（基因融合标签）
FITC	495 / 519 nm	抗体标记
Cy3	550 / 570 nm	抗体标记
Cy5	650 / 670 nm	抗体标记
Alexa 568	578 / 603 nm	抗体标记

4. 共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）

与常规荧光显微镜的关键区别

普通荧光显微镜会收集来自焦平面以外（上下层）的荧光，导致图像模糊。共聚焦显微镜通过**针孔（pinhole）**只收集焦平面上的光，从而排除焦外光，获得清晰的光学切片（optical section）。

主要应用

Z 轴序列扫描（Z-stack）：逐层扫描，重建细胞或组织的三维结构；
最大强度投影（Maximum Intensity Projection, MIP）：将 Z-stack 中各层最亮点投影到一张图上；
多色成像：同时观察多种蛋白定位；
活细胞成像：观察动态过程。

课件中的例子： 海胆受精卵有丝分裂纺锤体（anti-tubulin 抗体染色），普通荧光下模糊，共聚焦下可清晰看到纺锤体微管纤维。

5. 超分辨率成像技术

技术	原理简述
SIM（structured illumination microscopy）	用结构化照明图案提高分辨率
STORM（stochastic optical reconstruction microscopy）	单分子定位，逐点重建
Deconvolution（去卷积）	通过算法去除光学系统的模糊效应

课件中展示了 ERGIC 与 COPII、LC3 与 IL1B 等蛋白的超分辨率共定位图像，以及中国科学家李栋发展的 GI-SIM（grazing-incidence SIM）用于活细胞中溶酶体、ER、微管的动态成像。

6. 无标记三维光学衍射断层扫描（ODT）

课件中提到陈良怡教授发展的 label-free 3D optical diffraction tomography (ODT)，无需荧光标记即可获得细胞的三维折射率分布图像。

7. 间接免疫细胞化学（Indirect Immunocytochemistry）

原理

一抗（primary antibody）：识别目标抗原（antigen A）；
二抗（secondary antibody）：带有荧光染料、辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）或胶体金等标记，识别一抗。

优点

信号放大：多个二抗可结合一个一抗；
通用性：同一二抗可用于多种一抗；
标记灵活：可换不同标记的二抗实现不同检测目的。

8. 时间延迟显微技术（Time-lapse Microscopy）

在活细胞培养条件下，按固定时间间隔连续拍照，观察细胞运动、分裂、囊泡运输等动态过程。课件中展示了培养成纤维细胞在 0–34 min 内的运动过程。

三、电子显微镜（Electron Microscopy, EM）

1. 为什么需要电子显微镜？

电子束的波长远小于可见光（约 0.004 nm），因此电子显微镜的分辨率远高于光学显微镜，可达 0.1–0.2 nm（原子级）。但电子束在空气中会被散射，因此电镜需要高真空，样品必须固定、脱水、包埋，不能观察活细胞。

2. 透射电镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）

原理

电子束穿过超薄切片（通常 50–100 nm），经电磁透镜聚焦成像。样品中电子密度高的区域（如被锇酸染色的膜）散射电子，在图像上显示为暗区。

样品制备流程

固定（fixation）：常用戊二醛（glutaraldehyde）和四氧化锇（OsO₄）；
脱水：乙醇或丙酮梯度脱水；
包埋（embedding）：环氧树脂（如 Epon、Araldite）；
超薄切片（ultrathin sectioning）：用超薄切片机切 50–100 nm 薄片；
染色：醋酸铀、柠檬酸铅等重金属染色。

应用

观察细胞内部超微结构（细胞器、膜、核糖体、细胞骨架）；
免疫电镜（immuno-EM）：用胶体金标记抗体，定位特定蛋白。

3. 扫描电镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）

原理

电子束扫描样品表面，收集二次电子（secondary electrons）或背散射电子成像。样品表面需喷镀金属（如金、铂）以增加导电性并防止电子积累。

应用

观察细胞表面形貌（微绒毛、纤毛、伪足、细胞间连接）；
立体感强，适合表面结构研究。

4. 冷冻蚀刻（Freeze-Etching / Freeze-Fracture）

原理

样品快速冷冻；
用刀片断裂，断裂面常沿脂双层中间走；
升华表面冰（etching）暴露更多结构；
喷镀铂-碳形成 replica（复型）；
用 TEM 观察复型。

应用

观察膜内蛋白颗粒分布（如质膜 P 面与 E 面）；
观察核孔、紧密连接、间隙连接等膜结构。

5. 冷冻电镜（Cryo-Electron Microscopy, Cryo-EM）

原理

样品在玻璃态冰（vitreous ice）中快速冷冻，不经过固定和染色，保持近生理状态。通过单颗粒重建（single-particle reconstruction）或电子断层扫描（electron tomography）解析结构。

应用

解析蛋白质、病毒、核糖体等大分子复合物的高分辨率结构；
2017 年诺贝尔化学奖授予 Jacques Dubochet、Joachim Frank、Richard Henderson。

6. 其他电子显微技术

技术	原理与应用
负染（negative staining）	用重金属盐（如磷钨酸）包裹样品，样品呈亮区，适合观察病毒、蛋白纤维、微丝
免疫胶体金（immunogold）	金颗粒标记抗体，用于定位特定蛋白（如过氧化物酶体中的过氧化氢酶）
原子力显微镜（AFM）	通过探针与样品表面原子间作用力成像，可获得纳米级表面形貌
扫描隧道显微镜（STM）	利用隧道电流，可达单原子分辨率，可在低温下操纵原子

四、荧光探针与流式细胞术

1. 检测细胞内 Ca²⁺

探针	原理
水母素（aequorin）	来自水母的发光蛋白，与 Ca²⁺ 结合后发光，可检测细胞内 Ca²⁺ 变化
Fura-2	荧光染料，与 Ca²⁺ 结合后激发光谱发生偏移，可定量细胞内 Ca²⁺ 浓度

课件中展示了 Fura-2 在小脑浦肯野细胞（Purkinje cell）中显示 Ca²⁺ 浓度梯度的图像，颜色从蓝到红表示 Ca²⁺ 浓度由低到高。

2. GFP：活细胞蛋白定位的利器

来自水母（jellyfish）的绿色荧光蛋白；
发色团（chromophore）由三个氨基酸残基翻译后形成；
通过基因融合（GFP tag）可追踪目标蛋白的定位和动态；
变体：CFP（青色）、YFP（黄色）、RFP（红色）等，用于多色成像和 FRET。

3. 荧光激活细胞分选（Fluorescence-Activated Cell Sorter, FACS）

原理

细胞悬液经喷嘴形成液滴；
激光照射液滴中的细胞，检测荧光信号和散射光；
带电荷的液滴在电场中偏转，分选到不同收集管中。

应用

根据表面标志物分选特定细胞类型；
定量检测细胞内蛋白质和核酸含量；
单细胞分选用于单细胞测序。

五、同位素示踪（Isotope Probes）

1. 常用放射性同位素

同位素	半衰期	用途
\(^{32}\text{P}\)	14 天	标记 ATP、核酸
\(^{131}\text{I}\)	8.1 天	标记蛋白质（也发 γ 射线）
\(^{35}\text{S}\)	87 天	标记蛋白质（甲硫氨酸/半胱氨酸）
\(^{14}\text{C}\)	5570 年	标记有机物
\(^{45}\text{Ca}\)	164 天	标记钙
\(^{3}\text{H}\)	12.3 年	标记小分子、核苷酸

2. 脉冲-追踪实验（Pulse-Chase）

原理

脉冲（pulse）：短时间内加入放射性标记物（如 \(^{35}\text{S}\)-Met），新合成的蛋白质被标记；
追踪（chase）：洗去放射性标记，换成非放射性培养基，随时间取样；
观察放射性在不同细胞组分或不同蛋白形式中的分布变化。

经典应用

胰岛素生物合成追踪：Palade 等用脉冲-追踪结合 EM 放射自显影，证明分泌蛋白从 ER → Golgi → 分泌颗粒的运输路径；
激素分泌与受体周转：如 SRIF 分泌、TGF-β 受体（TβRII）成熟与降解。

六、细胞组分分离（Cell Fractionation）

1. 基本原理

细胞匀浆（homogenate）后，不同细胞器因大小、形状、密度不同，在离心力场中沉降速度不同，从而被分离。

2. 差速离心（Differential Centrifugation）

按离心力从小到大逐级离心，依次沉淀不同组分：

离心条件（示例）	沉淀组分
600 × g，10 min	细胞核（nuclei）
15,000 × g，5 min	线粒体、叶绿体、溶酶体、过氧化物酶体
100,000 × g，60 min	质膜、微粒体（ER 碎片）、大得多核糖体
300,000 × g，2 h	核糖体亚基、小多核糖体
上清	细胞质基质（cytosol）

3. 速度沉降 vs 平衡沉降

类型	原理	应用
速度沉降（velocity sedimentation）	在蔗糖梯度（5–20%）中按大小和形状不同沉降速度分离	分离不同大小的细胞器或复合物
平衡沉降（equilibrium sedimentation）	在陡蔗糖梯度（如 20–70%）或 CsCl 梯度中，颗粒移动到密度相等的位置	分离不同密度的细胞器（如溶酶体 1.12、线粒体 1.18、过氧化物酶体 1.23 g/cm³）

4. 免疫纯化（Immuno-purification）

用针对特定蛋白的抗体（如 anti-clathrin）结合到固相支持物上，从细胞匀浆中特异性捕获带该蛋白的囊泡或复合物（如网格蛋白包被囊泡）。

5. 无细胞体系（Cell-Free Systems）

在体外用分离的组分重建细胞过程，是研究机制的重要手段。

经典例子

Golgi 囊泡运输：Rothman 等将来自突变细胞（缺乏 GlcNAc 转移酶 I）的“供体”Golgi 与野生型“受体”Golgi 混合，加入 ATP 和细胞质，检测病毒糖蛋白是否被 \(^{3}\text{H}\)-GlcNAc 修饰，证明囊泡在 Golgi 堆叠间运输。
LC3 脂化实验：用 Atg5 敲除细胞的膜与野生型细胞质混合，加入 GTP 和 ATP，检测 LC3-I 向 LC3-II 的转化（自噬体形成的关键步骤）。

意义： 无细胞体系使复杂的细胞过程可以在受控条件下拆解分析，是细胞生物学研究的核心策略之一。

七、蛋白质纯化与检测

1. 柱层析（Column Chromatography）

类型	原理	特点
凝胶过滤（gel-filtration / size-exclusion）	多孔珠，小分子进入孔内被滞留，大分子先流出	按大小分离，大分子先出
离子交换（ion-exchange）	带电荷的珠与带相反电荷的蛋白结合，用盐梯度洗脱	按电荷分离
亲和层析（affinity）	固相上偶联特定配体（如抗体、底物、谷胱甘肽），特异结合目标蛋白	纯度最高，常作为最后一步

2. SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）

原理

SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质变性并带上均匀负电荷；
巯基乙醇（mercaptoethanol）还原二硫键；
蛋白质在电场中按分子量分离，小分子跑得快。

应用

检测蛋白质纯度；
估计分子量；
配合免疫印迹（Western blot）检测特定蛋白。

3. 等电聚焦（Isoelectric Focusing, IEF）

原理

在 pH 梯度中，蛋白质移动到其**等电点（pI）**位置时净电荷为零，不再迁移。

4. 双向凝胶电泳（2D Gel）

原理

第一维：IEF，按 pI 分离；
第二维：SDS-PAGE，按分子量分离。

应用

分离复杂蛋白质混合物（如全细胞裂解液）；
比较不同处理条件下蛋白质表达差异；
配合质谱鉴定蛋白质。

5. 免疫印迹（Immunoblotting / Western Blot）

流程

SDS-PAGE 分离蛋白质；
电转移（electrotransfer）到膜上（如硝酸纤维素膜、PVDF 膜）；
一抗孵育，识别目标蛋白；
酶标二抗孵育；
加底物显色或化学发光检测。

应用

检测特定蛋白的表达与分子量；
半定量比较不同样品中蛋白表达水平。

6. 质谱（Mass Spectrometry, MS）

原理

蛋白质酶切（如胰蛋白酶）成肽段；
肽段电离（如 MALDI 或 ESI）；
测量肽段的质荷比（m/z）；
与数据库比对，鉴定蛋白质。

应用

从 2D 胶中切取单个蛋白点进行鉴定；
大规模蛋白质组学分析；
串联质谱（MS/MS）可推断部分氨基酸序列。

八、蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interactions, PPI）

1. GST Pull-Down

原理

将目标蛋白 X 与 GST（谷胱甘肽 S-转移酶）融合表达；
融合蛋白结合到谷胱甘肽包被的珠上；
加入细胞裂解液，与 X 互作的蛋白被捕获；
用谷胱甘肽洗脱，SDS-PAGE 检测。

应用

体外验证已知或推测的蛋白互作；
筛选互作蛋白。

2. FRET（荧光共振能量转移）

原理

两个荧光蛋白（如 CFP 和 YFP）分别融合到蛋白 X 和 Y；
当 X 和 Y 距离足够近（<10 nm）时，激发 CFP 可导致 YFP 发射荧光（能量转移）；
检测 YFP 荧光即可判断互作。

应用

活细胞中实时监测蛋白互作；
检测构象变化。

3. 酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid）

原理

将诱饵蛋白（bait）与 DNA 结合域（BD）融合；
将猎物蛋白（prey）与转录激活域（AD）融合；
若 bait 与 prey 互作，BD 与 AD 靠近，激活报告基因表达。

应用

筛选 cDNA 文库中的互作蛋白；
验证已知互作。

4. 噬菌体展示（Phage Display）

原理

将外源肽段或蛋白与噬菌体外壳蛋白融合，展示在噬菌体表面；
用靶分子（如抗体、受体）筛选结合的噬菌体；
回收并测序，获得编码序列。

应用

筛选特异性结合肽或抗体；
课件例子：将噬菌体文库注射到脑肿瘤小鼠体内，筛选能特异性结合肿瘤血管的肽段。

5. 表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR / Biacore）

原理

将诱饵分子固定在金膜表面；
流入猎物分子溶液；
分子结合改变金膜表面折射率，导致共振角变化；
实时监测结合（association）和解离（dissociation）曲线，计算 \(K_d\)。

应用

定量测定蛋白-蛋白、蛋白-小分子、抗原-抗体的结合亲和力；
无需标记，实时检测。

九、分子生物学与遗传学方法

1. 定点突变（Site-Directed Mutagenesis）

原理

设计含突变碱基的寡核苷酸引物；
以质粒模板进行 PCR 扩增；
DNA 聚合酶延伸、连接酶封闭；
转化细胞，筛选含突变基因的克隆。

应用

研究特定氨基酸对蛋白功能的影响；
构建点突变疾病模型。

2. 将物质导入细胞

方法	原理
显微注射（microinjection）	玻璃微针直接注射到细胞质或细胞核
电穿孔（electroporation）	短暂电脉冲在膜上形成瞬时可逆孔道
脂质体介导（lipid-mediated）	脂质体与质膜融合，将内容物释放到细胞质
金颗粒介导（gold particle-mediated / gene gun）	DNA 包被金颗粒，高压射入细胞

3. 异位过表达（Ectopic Misexpression）

在非正常位置或时间表达某基因，观察表型变化。

课件例子

Wnt 异位表达：在胚胎中异位表达 Wnt，导致形成第二体轴；
Dapper2 过表达：在斑马鱼中过表达 Dapper2，导致眼睛融合（eye fusion），证明其在发育中的作用（Zhang et al., 2004, Science）。

4. RNA 干扰（RNA Interference, RNAi）

原理

双链 RNA（dsRNA）被 Dicer 切割成小干扰 RNA（siRNA）；
siRNA 与 RISC 复合物结合，降解同源 mRNA；
导致基因表达敲低（knockdown），而非完全敲除。

形式

siRNA：体外合成，直接导入细胞，瞬时敲低；
shRNA：通过载体在细胞内表达短发夹 RNA，可稳定敲低。

应用

研究基因功能；
课件例子：线虫（C. elegans）中通过喂食表达 dsRNA 的 E. coli 实现基因敲低。

5. 基因敲除、敲入与替换

类型	结果
基因替换（gene replacement）	用突变基因替换正常基因，只有突变基因有活性
基因敲除（gene knockout）	破坏目标基因，使其无活性
基因添加（gene addition）	在基因组中额外插入一个基因，正常基因和额外基因都有活性

6. 基因敲除小鼠的制备

流程

构建含同源臂的替换载体（含 neo\(^r\) 正筛选标记和 tk\(^{HSV}\) 负筛选标记）；
电穿孔导入 ES 细胞；
同源重组（homologous recombination）：目标基因被破坏；
随机插入（nonhomologous recombination）：tk 基因插入，细胞对 ganciclovir 敏感；
用 neomycin（正筛选）和 ganciclovir（负筛选）筛选；
将正确重组的 ES 细胞注射到囊胚腔；
产生嵌合体小鼠（chimeric mice）；
与野生型小鼠交配，获得杂合子；
杂合子互交，获得纯合敲除小鼠。

7. 条件性敲除：LoxP-Cre 系统

原理

LoxP：34 bp 的 DNA 识别位点；
Cre 重组酶：来自 P1 噬菌体，识别 LoxP 位点并介导重组；
将 LoxP 位点置于目标基因两侧（floxed 基因）；
在表达 Cre 的细胞中，LoxP 位点间的序列被切除，实现组织特异性或时间特异性敲除。

应用

研究特定组织或发育阶段中基因的功能；
避免全身敲除导致的胚胎致死。

8. CRISPR/Cas9 基因编辑

原理

Cas9：核酸内切酶，在 guide RNA（gRNA）引导下切割目标 DNA；
gRNA：与目标 DNA 互补配对（约 20 nt）；
切割后通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）实现基因敲除或敲入。

优点

操作简单、效率高、可同时编辑多个基因；
2020 年诺贝尔化学奖授予 Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer Doudna。

9. RNA-seq

原理

提取 mRNA；
片段化；
反转录为 cDNA；
加接头、PCR 扩增；
高通量测序（如 Illumina）；
比对到参考基因组，定量基因表达。

应用

同时监测数千个基因的表达；
比较不同处理、不同发育阶段或不同疾病状态的转录组差异；
聚类分析（clustering）可发现共表达基因模块（如胆固醇合成、细胞周期、伤口愈合相关基因）。

十、模式生物（Model Organisms）

模式生物	研究优势	主要应用
病毒（viruses）	结构简单、基因组小	DNA/RNA/蛋白质合成、基因调控、癌症、基因治疗
细菌（bacteria）	繁殖快、遗传操作方便	DNA/RNA/蛋白质合成、代谢、抗生素靶点、细胞周期、信号转导
*酵母（S. cerevisiae）*	真核生物、遗传操作成熟	细胞周期、蛋白质分泌、膜生物发生、细胞骨架、衰老、基因调控
*线虫（C. elegans）*	细胞数目恒定、谱系清楚	体轴发育、细胞谱系、神经系统、程序性细胞死亡、衰老、行为
*果蝇（D. melanogaster）*	遗传学经典、发育机制保守	体轴发育、细胞分化、神经系统、心脏、肌肉、程序性细胞死亡、癌症基因、行为
*斑马鱼（D. rerio）*	脊椎动物、胚胎透明、体外发育	脊椎动物组织发育、脑和神经系统、出生缺陷、癌症
*小鼠（M. musculus）*	哺乳动物、与人类亲缘近	组织发育、免疫系统、脑和神经系统、人类疾病模型、基因调控、传染病
*拟南芥（A. thaliana）*	植物模式生物、基因组小	植物组织发育、细胞生物学遗传学、农业应用、生理、免疫

保守基因的例子

Hox 基因：在果蝇和哺乳动物中均控制体轴发育；
Pax6 / eyeless：果蝇的 eyeless 基因与哺乳动物的 Pax6 同源，均控制眼睛发育；人类 PAX6 突变导致无虹膜症（aniridia）。

意义： 模式生物研究表明，许多控制发育和细胞过程的基因在进化中高度保守，因此可以从简单生物的研究推及人类。

十一、本章关键点总结

主题	核心要点
光学显微镜	明场、相差、DIC、暗场；荧光显微镜；共聚焦排除焦外光；超分辨率（SIM、STORM）
电子显微镜	TEM 看内部超微结构；SEM 看表面形貌；冷冻蚀刻看膜内结构；cryo-EM 解析大分子结构
荧光探针	GFP 标记蛋白；fura-2 检测 Ca²⁺；FACS 分选细胞
同位素	\(^{32}\text{P}\) 标记核酸/ATP；\(^{35}\text{S}\) 标记蛋白；脉冲-追踪研究动态过程
细胞组分分离	差速离心按大小分离；密度梯度离心按密度分离；无细胞体系重建细胞过程
蛋白质纯化	凝胶过滤按大小；离子交换按电荷；亲和层析按特异结合；SDS-PAGE 按分子量
蛋白质检测	Western blot 检测特定蛋白；质谱鉴定蛋白质
蛋白质互作	GST pull-down（体外）、FRET（活细胞）、酵母双杂交（筛选）、噬菌体展示（筛选）、SPR（定量亲和力）
基因功能研究	定点突变、RNAi 敲低、基因敲除/敲入、LoxP-Cre 条件敲除、CRISPR/Cas9 编辑、RNA-seq 转录组分析
模式生物	病毒、细菌、酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、拟南芥；基因功能高度保守

十二、复习自测题

比较明场、相差、DIC、暗场四种光学显微技术的原理和适用场景。
荧光显微镜的光路中，激发滤光片、二向色镜和发射滤光片各起什么作用？
共聚焦显微镜为什么能获得清晰的光学切片？它与普通荧光显微镜的关键区别是什么？
TEM 和 SEM 的成像原理有何不同？各自适合观察什么结构？
冷冻蚀刻技术为什么能显示膜内蛋白颗粒？P 面和 E 面分别代表什么？
差速离心分离细胞器时，细胞核、线粒体、微粒体、核糖体分别在哪一级沉淀？
速度沉降和平衡沉降的区别是什么？各自根据什么物理量分离？
凝胶过滤、离子交换、亲和层析分别按什么原理分离蛋白质？哪一种纯度最高？
SDS-PAGE 中 SDS 和巯基乙醇各起什么作用？蛋白质按什么顺序迁移？
GST pull-down、FRET、酵母双杂交、噬菌体展示、SPR 各适合研究蛋白质互作的哪个方面？
基因敲除（knockout）和基因敲低（knockdown）有什么区别？各自常用什么方法实现？
LoxP-Cre 系统如何实现组织特异性基因敲除？与全身敲除相比有什么优势？
CRISPR/Cas9 的基本原理是什么？gRNA 和 Cas9 各起什么作用？
为什么模式生物的研究结果可以推及人类？请举一个保守基因的例子。

十三、解答

比较明场、相差、DIC、暗场四种光学显微技术的原理和适用场景。

· 明场 (Bright-field)：光直接透射过样品。对比度低，适合观察染色后的固定样品。 · 相差 (Phase-contrast)：将光通过透明样品产生的相位差转换为亮度差。适合观察未染色的活细胞内部结构。 · DIC (微分干涉)：利用偏振光分成两束相干光再干涉。呈现浮雕感（厚度差），适合观察活细胞动态。 · 暗场 (Dark-field)：只收集样品侧面散射的光。背景暗、样品亮，适合观察未染色的透明微小结构。

荧光显微镜的光路中，激发滤光片、二向色镜和发射滤光片各起什么作用？

· 激发滤光片 (Excitation filter)：只允许特定波长的激发光通过，阻挡其他波长。 · 二向色镜 (Dichroic mirror)：反射短波长的激发光至样品，透射长波长的发射光。 · 发射滤光片 (Emission filter)：只允许特定波长的发射荧光通过，彻底阻挡残余的激发光。

共聚焦显微镜为什么能获得清晰的光学切片？它与普通荧光显微镜的关键区别是什么？

· 原理：共聚焦显微镜在检测器前有一个针孔 (Pinhole)，只允许来自焦平面的光通过，阻挡了焦外上下层的杂散光。 · 关键区别：普通荧光显微镜收集整个深度的光导致图像模糊；共聚焦能进行逐层扫描（Z-stack），获得极薄的清晰光学切片，并可进行三维重建。

TEM 和 SEM 的成像原理有何不同？各自适合观察什么结构？

· TEM (透射电镜)：电子束穿过超薄切片，电子密度高的区域散射电子呈暗区。适合观察细胞内部的超微结构。 · SEM (扫描电镜)：电子束扫描样品表面，收集二次电子成像。样品需喷镀金属。适合观察细胞或组织的表面 3D 形貌。

冷冻蚀刻技术为什么能显示膜内蛋白颗粒？P 面和 E 面分别代表什么？

· 原理：样品冷冻后用刀劈裂，断裂面往往沿着脂双层疏水核心（中间）裂开，从而暴露出嵌在膜内的蛋白颗粒。 · P 面 (Protoplasmic face)：靠近细胞质侧的内层小叶（含蛋白颗粒多）。 · E 面 (Ectoplasmic face)：靠近细胞外侧或内腔侧的外层小叶。

差速离心分离细胞器时，细胞核、线粒体、微粒体、核糖体分别在哪一级沉淀？

· 细胞核：最低转速（如 600g）。 · 线粒体：中等转速（如 15,000g）。 · 微粒体 (ER碎片)：较高转速（如 100,000g）。 · 核糖体：最高转速（如 300,000g）。

速度沉降和平衡沉降的区别是什么？各自根据什么物理量分离？

· 速度沉降：在较浅的梯度中，根据颗粒的大小和形状不同（沉降系数不同）进行分离。 · 平衡沉降：在陡峭的密度梯度中，颗粒下沉或上浮直到到达与其自身密度相等的位置悬浮。

凝胶过滤、离子交换、亲和层析分别按什么原理分离蛋白质？哪一种纯度最高？

· 凝胶过滤：按分子大小分离（大分子进不去孔，先洗脱）。 · 离子交换：按表面电荷差异分离。 · 亲和层析：按特异性生物相互作用（如抗原-抗体、酶-底物）分离。 · 纯度最高：亲和层析（通常作为最后一步纯化）。

SDS-PAGE 中 SDS 和巯基乙醇各起什么作用？蛋白质按什么顺序迁移？

· SDS：使蛋白质变性，并赋予多肽链均匀的负电荷，消除了不同蛋白质之间的电荷差异。 · 巯基乙醇：还原并破坏二硫键，使蛋白质完全解折叠为线性多肽。 · 迁移顺序：按分子量大小分离，分子量越小的多肽在凝胶中迁移得越快（越靠下）。

GST pull-down、FRET、酵母双杂交、噬菌体展示、SPR 各适合研究蛋白质互作的哪个方面？

· GST pull-down：体外验证或寻找与已知诱饵蛋白直接互作的蛋白。 · FRET：活细胞内实时监测蛋白-蛋白空间距离或互作。 · 酵母双杂交：活细胞内高通量筛选未知的互作蛋白（cDNA文库）。 · 噬菌体展示：高通量筛选特异性结合靶标的多肽或抗体。 · SPR (Biacore)：定量测定分子间的结合亲和力（K_d）及动力学常数（结合/解离速率）。

基因敲除（knockout）和基因敲低（knockdown）有什么区别？各自常用什么方法实现？

· Knockout (敲除)：通过DNA层面的改变，彻底破坏基因序列，导致蛋白完全不表达。常用方法：同源重组（ES细胞打靶）、CRISPR/Cas9。 · Knockdown (敲低)：在RNA或翻译层面抑制表达，降低蛋白水平但不清零。常用方法：RNA干扰（siRNA, shRNA）。

LoxP-Cre 系统如何实现组织特异性基因敲除？与全身敲除相比有什么优势？

· 原理：将目标基因两侧装入 LoxP 位点（floxed 小鼠），与表达组织特异性启动子驱动的 Cre 重组酶转基因小鼠交配。Cre 酶只在特定组织中表达，从而仅切除该组织中的目标基因。 · 优势：避免全身敲除导致的胚胎致死；可研究特定成体组织或细胞中基因的功能。

CRISPR/Cas9 的基本原理是什么？gRNA 和 Cas9 各起什么作用？

· 原理：利用细菌的获得性免疫机制进行基因编辑。 · gRNA (引导RNA)：识别并结合靶标 DNA 序列（通过碱基互补配对）。 · Cas9 (核酸内切酶)：在 gRNA 的引导下，在靶标 DNA 上产生双链断裂，诱发细胞进行非同源末端连接（NHEJ，导致敲除）或同源定向修复（HDR，用于敲入）。

为什么模式生物的研究结果可以推及人类？请举一个保守基因的例子。

· 原因：生命进化具有高度的保守性。许多控制基本细胞活动（如细胞周期、代谢）和早期发育的基因在真核生物乃至更广的物种间高度相似。 · 例子：Hox 基因在果蝇和哺乳动物中都控制体轴的发育；Pax6/eyeless 基因控制眼睛发育（果蝇 eyeless 与人类 PAX6 突变导致无虹膜症）。

参考文献与延伸阅读

Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell, 7th Ed. W. W. Norton & Company, 2022.
Lodish, H., et al. Molecular Cell Biology, 9th Ed. W. H. Freeman, 2021.
丁明孝、王喜忠、张传茂、陈建国主编，《细胞生物学》（第五版），高等教育出版社，2020.
陈晔光、陈建国主编，《细胞生物学》，高等教育出版社，2025.
Rothman, J. E. (2014). The principle of membrane fusion in the cell (Nobel Lecture). Angewandte Chemie International Edition, 53(47), 12676–12694.
Zhang, M., et al. (2020). A translocated channel for unconventional protein secretion. Cell, 182(4), 917–932.

说明： 侧重于每种方法“为什么这样设计”和“能解决什么问题”，具体操作步骤仅作简要说明。考试中若涉及方法选择，应从样品类型（活细胞/固定样品）、分辨率需求、是否需要标记、是否定量等角度分析。

Microscopy on SHY's LAND

细胞生物学学习笔记 2 | 细胞生物学研究方法：从显微成像到基因编辑

细胞生物学学习笔记 2 | 细胞生物学研究方法：从显微成像到基因编辑

一、本章总览：研究细胞的方法体系

二、光学显微镜（Light Microscopy）

1. 分辨率基础

2. 四种观察活细胞的光学显微技术

3. 荧光显微镜（Fluorescence Microscopy）

基本原理

光路关键部件

常用荧光染料与蛋白

4. 共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）

与常规荧光显微镜的关键区别

主要应用

5. 超分辨率成像技术

6. 无标记三维光学衍射断层扫描（ODT）

7. 间接免疫细胞化学（Indirect Immunocytochemistry）

原理

优点

8. 时间延迟显微技术（Time-lapse Microscopy）

三、电子显微镜（Electron Microscopy, EM）

1. 为什么需要电子显微镜？

2. 透射电镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）

原理

样品制备流程

应用

3. 扫描电镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）

原理

应用

4. 冷冻蚀刻（Freeze-Etching / Freeze-Fracture）

原理

应用

5. 冷冻电镜（Cryo-Electron Microscopy, Cryo-EM）

原理

应用

6. 其他电子显微技术

四、荧光探针与流式细胞术

1. 检测细胞内 Ca²⁺

2. GFP：活细胞蛋白定位的利器

3. 荧光激活细胞分选（Fluorescence-Activated Cell Sorter, FACS）

原理

应用

五、同位素示踪（Isotope Probes）

1. 常用放射性同位素

2. 脉冲-追踪实验（Pulse-Chase）

原理

经典应用

六、细胞组分分离（Cell Fractionation）

1. 基本原理

2. 差速离心（Differential Centrifugation）

3. 速度沉降 vs 平衡沉降

4. 免疫纯化（Immuno-purification）

5. 无细胞体系（Cell-Free Systems）

经典例子

七、蛋白质纯化与检测

1. 柱层析（Column Chromatography）

2. SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）

原理

应用

3. 等电聚焦（Isoelectric Focusing, IEF）

原理

4. 双向凝胶电泳（2D Gel）

原理

应用

5. 免疫印迹（Immunoblotting / Western Blot）

流程

应用

6. 质谱（Mass Spectrometry, MS）

原理

应用

八、蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interactions, PPI）

1. GST Pull-Down

原理

应用

2. FRET（荧光共振能量转移）

原理

应用

3. 酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid）

原理

应用